中藥洗脫支架預(yù)防豬冠狀動(dòng)脈損傷后再狹窄的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來，人們不斷尋找有效的治療和預(yù)防再狹窄的藥物和方法。藥物洗脫支架，由于其在靶血管較高的藥物濃度，緩慢釋放性，較低全身副作用，成為近期的研究熱點(diǎn)。 目前在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有多種藥物洗脫支架應(yīng)用于臨床，主要包括抗血栓藥物如肝素洗脫支架、抗炎癥藥物支架如地塞米松洗脫支架、抗增生藥物支架如紫杉醇和雷帕霉素。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明除抗增殖藥物外，其他藥物支架并沒有明顯減輕血管內(nèi)膜增生的作用，雷帕霉素和紫杉醇洗脫支架均顯示出良好的減少支架后再狹窄的性能

2、，這些結(jié)果都為開發(fā)新型藥物洗脫支架藥物提供了借鑒。中藥具有來源廣泛、價(jià)格低廉、副作用少等優(yōu)點(diǎn)，隨著分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)中藥的有效成分研究得更加透徹，對(duì)中藥的藥理作用已經(jīng)研究到分子、基因水平，為我們提供了有的放矢地選擇可以有效防治再狹窄的中藥用于藥物洗脫支架的契機(jī)。通過對(duì)中藥防治再狹窄的相關(guān)文獻(xiàn)的復(fù)習(xí)，我們選取了青蒿素(artemisinin,Art)，白藜蘆醇(resveratrol，Res)及雷公藤甲素(triptol

3、id，Tri)等中藥提純物進(jìn)行了體外細(xì)胞研究，并從中篩選出雷公藤甲素制作藥物洗脫支架進(jìn)行在體防治再狹窄的實(shí)驗(yàn)研究。 一、中藥抑制平滑肌細(xì)胞增殖的體外實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈平滑肌，應(yīng)用青蒿素、白藜蘆醇、雷公藤甲素等中藥進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)于平滑肌增殖作用的影響，篩選陽性結(jié)果的中藥制作洗脫支架用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。 (一)細(xì)胞培養(yǎng)貼塊法培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈平滑肌(VSMC)。引頸處死大鼠，無菌操作下迅速取出胸主動(dòng)脈，縱向切開，鈍性去除內(nèi)

4、外膜，剪成1mm3組織塊，接種于25ml培養(yǎng)瓶，放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中，組織塊貼壁后加入含20％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，靜止培養(yǎng)。7～12天可見VSMC由組織塊邊緣爬出，覆蓋大部分表面時(shí)傳代。實(shí)驗(yàn)用第4～6代細(xì)胞。光鏡下VSMC呈極性生長(zhǎng)，典型“峰”、“谷”排列。 (二)實(shí)驗(yàn)分組分為不同濃度Art組和對(duì)照組。0.25％胰蛋白酶消化VSMC，用10％FCSRPMI1640培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，以每孔103～104

5、接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200μl，培養(yǎng)3天。再分別加入不同濃度的Art(10，20，40，80，160mg/l)，Res(4.0×10-5，8.0×10-5，1.2×10-4，1.6×10-4，2.0×10-4mol/l)，Tri(2.5×10-6，5×10-6，1×10～，2×10-5，4×10-5g/l)，孵育24h。每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。 (三)Art，Res，Tri對(duì)VSMC增殖的影響每孔加入MTT溶液20μl，繼續(xù)孵

6、育4h。棄上清液，再加入150μlDMSO,振蕩10min，于酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度值(A)。各組每天取1塊培養(yǎng)板測(cè)定A值，最后以時(shí)間為橫軸，A為縱軸繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果表明，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線近似“S”形，Art在10～160mg/l濃度范圍內(nèi)可抑制VSMC的增殖，；Res在4.0×10-5-2.0×10-4mol/1濃度范圍內(nèi)可抑制VSMC的增殖；Tri各濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)均有明顯抑制作用(P＜001)，生長(zhǎng)曲線不同程度的壓低。

7、其細(xì)胞計(jì)數(shù)與對(duì)照組相比有明顯差異(P＜0.05)，且呈劑量依賴性。 (四)Art，Res，Tri對(duì)VSMCDNA合成的影響細(xì)胞收集前6～8h每孔加入3H-TdR10μl。0.25％胰蛋白酶消化，用多頭微量細(xì)胞收集器將細(xì)胞收集于玻璃纖維濾膜上，80℃烘干，閃爍液中靜置24h后，用液體閃爍記數(shù)器測(cè)定每份樣品每min脈沖數(shù)(cpm)。以每105細(xì)胞的cpm值計(jì)算DNA合成量。結(jié)果表明，Art，Res，Tri可明顯抑制體外培養(yǎng)的VSMC

8、3H-TdR的摻入，并隨藥物劑量加大而抑制作用增強(qiáng)，呈明顯的劑量依賴關(guān)系。 (五)Art，Res，Tri對(duì)VSMC凋亡的影響單細(xì)胞懸液800r/min低速離心5min，再加少許溫Hank's液，吸管吹打均勻后，涂片晾干固定，HE染色觀察凋亡細(xì)胞。結(jié)果表明，HE染色對(duì)照組中無凋亡細(xì)胞，Art組可見較多凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核固縮深染，核碎裂并呈數(shù)個(gè)深藍(lán)色顆粒。單細(xì)胞懸液3000r/min離心5min，收集細(xì)胞，酚氯仿提取DNA，瓊脂糖凝膠

9、電泳，紫外線下觀察凋亡細(xì)胞DNA梯帶。瓊脂糖凝膠電泳時(shí)對(duì)照組無DNA梯形條帶，Art組出現(xiàn)細(xì)胞DNA梯形條帶，且輝光強(qiáng)度隨藥物濃度增大而變強(qiáng)，提示隨藥物濃度增大VSMC凋亡程度加重。單細(xì)胞懸液800r/min低速離心5min，加入碘化丙啶(PI)液染色，4℃避光放置30min，經(jīng)300目尼龍膜過濾，在流式細(xì)胞儀上測(cè)量濾液中細(xì)胞DNA變化。結(jié)果顯示對(duì)照組凋亡率為0.10％，Art(40mg/l)組凋亡率為12.93％，Art(160mg/

10、l)組凋亡率為38.72％，Res(4.0x10-5mol/l)組凋亡率為4.4％，Res(2.0x10-4mol/l)組凋亡率為35.8％，Tri(1×10-5g/l)組凋亡率為9.23％，Tri(4×10-5g/1)組凋亡率為27.45％。 (六)Art，Res，Tri對(duì)VSMC細(xì)胞周期的影響單細(xì)胞懸液800r/min低速離心5min，加入碘化丙啶(PI)液染色，4℃避光放置30min，經(jīng)300目尼龍膜過濾，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)

11、胞周期。經(jīng)Art處理后VSMC細(xì)胞周期分布與對(duì)照明顯不同，各期細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分率見表。與對(duì)照組相比，Art組在培養(yǎng)48h后，細(xì)胞的生長(zhǎng)被阻滯于G0/G1期，減少了進(jìn)入S期的細(xì)胞比例，并干擾了細(xì)胞由S期至G2/M期的發(fā)展。而且隨藥物濃度的增加，該作用更加明顯。Tri組Go/G1期細(xì)胞的分率較對(duì)照組低，S期細(xì)胞的百分率分別較對(duì)照組高，G2+M期細(xì)胞的百分率分別較對(duì)照組低。與對(duì)照組相比，在加藥培養(yǎng)48h后，可顯著增加進(jìn)入S期的細(xì)胞比例，

12、各用藥組與對(duì)照組相比P＜005；同時(shí)還可顯著減少進(jìn)入G2+M期的細(xì)胞比例，而且隨藥物濃度的增加，G2+M期細(xì)胞比例逐漸減少。 (七)結(jié)論以上實(shí)驗(yàn)觀察了青蒿素、白藜蘆醇及雷公藤甲素對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖、DNA合成及細(xì)胞周期的影響，證實(shí)了上述三種藥物對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，為下一步藥物洗脫支架所載藥物的選擇提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 二、雷公藤藥物洗脫支架的制備及藥物釋放研究(略） 三、雷公藤藥物

13、洗脫支架的在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究 (一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇豬的冠狀動(dòng)脈在大小，進(jìn)入路徑、對(duì)損傷反應(yīng)方面與人類相似，故選用健康的實(shí)驗(yàn)用小型豬。 (二)小型豬冠狀動(dòng)脈損傷模型的建立及支架植入小型豬以安定5mg/kg和氯胺酮10mg/kg肌肉注射行基礎(chǔ)麻醉，硫噴妥鈉5mg/kg靜滴維持。分離、穿刺股動(dòng)脈，置入7F動(dòng)脈鞘，行冠狀動(dòng)脈造影。選擇左前降支，右冠狀動(dòng)脈的合適血管段，定量冠狀動(dòng)脈造影(QCA)測(cè)定其直徑，于冠狀動(dòng)脈前降支和右冠冠狀

14、動(dòng)脈分別植入不同支架。帶支架球囊以球囊/血管1.3：1的比例，用10～15大氣壓、15s單次過度擴(kuò)張血管形成冠狀動(dòng)脈損傷模型。每頭小型豬分別被植入雷公藤甲素洗脫支架、裸金屬支架或單涂層支架中的2枚。術(shù)后常規(guī)復(fù)查冠狀動(dòng)脈造影及冠狀動(dòng)脈內(nèi)超聲。術(shù)中應(yīng)用肝素200U/kg。所有動(dòng)物術(shù)前3天給予阿司匹林+抵克力得治療直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束普通飼料飼養(yǎng)。 (三)冠狀動(dòng)脈造影及冠狀動(dòng)脈內(nèi)超聲評(píng)價(jià) 1.在第5周重復(fù)冠狀動(dòng)脈造影，QCA測(cè)定最小管

15、腔直徑。使用ANCOR計(jì)算機(jī)心血管圖像分析系統(tǒng)測(cè)定管腔狹窄直徑。 2.同時(shí)重復(fù)冠狀動(dòng)脈內(nèi)超聲，評(píng)價(jià)支架內(nèi)狹窄的發(fā)生情況。沿導(dǎo)絲送入血管內(nèi)超聲導(dǎo)管至支架上約1cm處，按2mm/s的速度勻速回拉，進(jìn)行血管內(nèi)超聲檢查并記錄結(jié)果。采用血管內(nèi)超聲檢查儀自帶軟件進(jìn)行分析。 (四)定量評(píng)價(jià)支架血管段組織的內(nèi)膜增生第5周處死小型豬、取出心臟，4％中性緩沖福爾馬林70mmHg加壓灌注固定20h后分離冠狀動(dòng)脈支架10mm內(nèi)的血管段，生理鹽水

16、沖洗。 1.取材部位：剪取支架血管段的近、中和遠(yuǎn)端三個(gè)部分為病理組織標(biāo)本。同時(shí)取近支架邊緣5mm內(nèi)的血管段。4％中性緩沖福爾馬林固定。 2.切片及染色：帶金屬支架標(biāo)本硬塑料包埋后，用骨科切片機(jī)切片，每段血管切2片，每支架共6片。不帶支架的邊緣血管段用石蠟包埋后普通切片機(jī)切片。所有切片用HE染色和Gieson彈力纖維染色制備光鏡標(biāo)本。 3.組織病理學(xué)檢查：組織切片用微圖像分析系統(tǒng)測(cè)定。用血管損傷積分標(biāo)準(zhǔn)(0分=內(nèi)彈

17、力膜完好，1分=內(nèi)彈力膜撕裂，2分=內(nèi)彈力膜和中膜撕裂，3分=外彈力膜撕裂)計(jì)算積分，取測(cè)定的平均值。測(cè)量支架段血管切片的管腔面積和冠脈橫斷面積，定量評(píng)價(jià)支架段血管組織內(nèi)膜增生的程度。 (五)結(jié)論確定了詳盡的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，為雷公藤甲素藥物洗脫支架在豬冠狀動(dòng)脈損傷后再狹窄的預(yù)防作用的研究的順利實(shí)施創(chuàng)造了條件。 四、結(jié)論 1.觀察了青蒿素、白藜蘆醇及雷公藤甲素對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖、DNA合成及細(xì)胞周期的