中東呼吸綜合征冠狀病毒受體結(jié)合功能區(qū)的免疫保護(hù)作用機(jī)制研究.pdf

1、新中東呼吸綜合癥（MERS）冠狀病毒（MERS-CoV）于2012年在沙特地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)，隨后，在全世界范圍內(nèi)傳播，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。MERS病毒感染已經(jīng)在27個(gè)國(guó)家地區(qū)出現(xiàn)，感染及死亡病例持續(xù)增加。截止2017年3月8日，世界衛(wèi)生組織報(bào)告的感染病例死亡病例分別為1917例和677例，病死率高于35％。針對(duì)MERS-CoV疫苗研究已廣泛開(kāi)展，目前，多種候選疫苗處于臨床前研究階段，尚無(wú)人用MERS疫苗上市。以MERS-CoV刺突糖蛋白（Sp

2、ike protein,S）受體結(jié)合區(qū)（Receptor Binding Domain,RBD）為抗原靶點(diǎn)的亞單位疫苗研究不斷深入，為MERS-CoV蛋白關(guān)鍵免疫保護(hù)功能區(qū)。前期研究中，針對(duì)免疫有效功能區(qū)段的優(yōu)化，免疫方案確定及免疫保護(hù)特性等方面進(jìn)行了深入的研究。但對(duì)于MERS-CoV RBD疫苗的免疫機(jī)制研究，仍存在一些問(wèn)題需解答，例如，自2012年首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，經(jīng)歷5年的流行及傳播，毒株出現(xiàn)多種突變，MERS-CoV RBD區(qū)段的突

3、變是否會(huì)引起免疫保護(hù)能力下降，而導(dǎo)致該區(qū)段不再適合作為疫苗研究靶點(diǎn)？是否可以通過(guò)模擬MERS-CoV RBD蛋白的天然構(gòu)象形式，設(shè)計(jì)MERS-CoV RBD構(gòu)象優(yōu)化疫苗，提高免疫保護(hù)效果？MERS-CoV RBD區(qū)所含免疫功能表位在其誘導(dǎo)免疫保護(hù)應(yīng)答中的作用如何，可否對(duì)其進(jìn)行精確評(píng)價(jià)？可否通過(guò)結(jié)構(gòu)優(yōu)化，對(duì)MERS-CoV RBD非中和免疫優(yōu)勢(shì)表位進(jìn)行封閉，促進(jìn)中和性免疫應(yīng)答反應(yīng)，使其對(duì)MERS-CoV產(chǎn)生完全免疫保護(hù)？為了回答以上問(wèn)題，

4、我們?cè)O(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)，對(duì)MERS-CoV RBD蛋白進(jìn)行了深入研究，進(jìn)一步多角度闡明其免疫保護(hù)機(jī)制。
　　1.MERS-CoV蛋白受體結(jié)合功能區(qū)誘導(dǎo)的免疫保護(hù)作用特征研究
　　依據(jù)2012-2015年間，所有不同地區(qū)，不同宿主來(lái)源的MERS-CoV流行株MERS-CoV RBD區(qū)突變情況，利用定點(diǎn)突變的方法，在EMC-RBD基礎(chǔ)上，構(gòu)建5種RBD疫苗株：2012-RBD，2013-RBD，2014-RBD，2015-RBD及C

5、amel-RBD，分別包含2012-2015年度，人源及駱駝源流行代表病毒株RBD區(qū)單個(gè)或多個(gè)突變位點(diǎn)，同時(shí)構(gòu)建表達(dá)MERS病毒S蛋白基因的真核載體，用于包裝17株2012-2015年代表性的人源及駱駝來(lái)源的MERS-CoV假病毒，以及5株單克隆抗體逃逸假病毒株。利用真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)，成功在293T細(xì)胞中，表達(dá)該5種MERS-CoV RBD蛋白，并成功包裝22株高滴度MERS-CoV假病毒，用于免疫血清交叉中和效果評(píng)價(jià)。利用免疫共沉淀法

6、，酶聯(lián)免疫吸附法和細(xì)胞流式法鑒定RBD蛋白與MERS-CoV受體DPP4的結(jié)合能力，結(jié)果表明，MERS-CoV RBD突變蛋白能夠有效地結(jié)合人源及駱駝來(lái)源的DPP4蛋白，且前者強(qiáng)于后者；利用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定MERS-CoV RBD蛋白與4種中和性單克隆抗體（鼠源單抗：Mersmab1，人源單抗：m336，m337和m338）的結(jié)合，結(jié)果與EMC-RBD蛋白無(wú)顯著差異，具有良好的抗原性；MERS-CoV RBD蛋白免疫小鼠血清，能夠誘導(dǎo)

7、高水平特異性抗體產(chǎn)生，且對(duì)17株2012-2015年代表性的人源及駱駝來(lái)源的MERS假病毒，5株單克隆抗體逃逸假病毒株，及2株活病毒具有強(qiáng)的交中和反應(yīng)。同時(shí)設(shè)計(jì)2種包含MERS-CoV受體結(jié)合域（RBM）關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的RBD蛋白：RBD-FGG和RBD-FGGAA，其功能性，抗原性及所誘導(dǎo)的交叉性中和抗體均有顯著減弱，然而，這種免疫逃逸是在MERS-CoV毒力及傳播流行能力下降甚至消失的情況下發(fā)生，自然情況下，該流行株不能存在，進(jìn)一步

8、證實(shí)了RBD作為亞單位疫苗靶點(diǎn)的可行性。因此，本部分研究證明MERS-CoV RBD作為重要的亞單位疫苗靶點(diǎn)能夠誘導(dǎo)高效廣譜的交叉保護(hù)性免疫，對(duì)人及駱駝來(lái)源的MERS-CoV流行株有交叉中和作用，為研發(fā)安全高效廣譜RBD疫苗提供重要的理論基礎(chǔ)。
　　2.類(lèi)天然構(gòu)象性三聚體MERS-CoV RBD重組蛋白免疫保護(hù)作用研究
　　基于第一部分研究結(jié)果，位于S蛋白內(nèi)的RBD區(qū)可作為廣譜疫苗研究的有效靶點(diǎn)，如何在此基礎(chǔ)上提高免疫保護(hù)效

9、果，闡明構(gòu)象性蛋白免疫保護(hù)功能區(qū)設(shè)計(jì)機(jī)制，成為下一個(gè)研究重點(diǎn)。MERS-CoV S蛋白在病毒表面形成天然三聚體結(jié)構(gòu)，本部分研究擬對(duì)RBD蛋白進(jìn)行構(gòu)象性?xún)?yōu)化與設(shè)計(jì)，通過(guò)重組融合三聚體形成單位，即Foldon序列，重組表達(dá)MERS-CoV RBD-Fd蛋白。以期通過(guò)形成三聚體蛋白，模擬病毒表面RBD蛋白天然構(gòu)象，繼而被開(kāi)發(fā)成既能發(fā)揮免疫保護(hù)功能的疫苗候選蛋白，又能有效阻斷病毒感染的治療性蛋白藥物。結(jié)果表明：首先，成功在真核系統(tǒng)表達(dá)出具有三聚

10、體構(gòu)象的MERS-CoV RBD-Fd蛋白，且能夠與MERS病毒受體DPP4高效結(jié)合，能夠有效阻斷MERS假病毒感染MERS病毒敏感細(xì)胞系。其次，動(dòng)物免疫及血清學(xué)檢驗(yàn)表明，RBD-Fd蛋白能夠有效誘導(dǎo)高滴度的中和抗體的產(chǎn)生，且能夠維持長(zhǎng)期保護(hù)性免疫應(yīng)答反應(yīng)。對(duì)人DPP4轉(zhuǎn)基因小鼠的活病毒攻毒試驗(yàn)產(chǎn)生良好的保護(hù)效果。
　　本部分研究重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)在以包膜糖蛋白為靶點(diǎn)的亞單位疫苗設(shè)計(jì)中天然構(gòu)象性抗原的作用，證明了基于免疫原天然構(gòu)象的疫苗設(shè)計(jì)

11、應(yīng)用于MERS-CoV RBD亞單位疫苗的可行性。為研發(fā)RBD為基礎(chǔ)的MERS預(yù)防及治療性藥物奠定基礎(chǔ)。
　　3.MERS-CoV病毒RBD關(guān)鍵位點(diǎn)糖基化修飾對(duì)免疫保護(hù)作用影響和機(jī)制研究
　　本部分研究通過(guò)闡明特定表位在MERS-CoV RBD蛋白在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和保護(hù)免疫所發(fā)揮的作用，鑒定非中和表位及免疫優(yōu)勢(shì)表位，進(jìn)一步揭示MERS-CoV RBD疫苗免疫保護(hù)機(jī)制并指導(dǎo)MERS-CoV RBD疫苗及其他病毒性亞單位疫苗的優(yōu)

12、化設(shè)計(jì)?；诘谝徊糠趾偷诙糠盅芯拷Y(jié)果，證實(shí)RBD存在特定表位的改變所引發(fā)的免疫應(yīng)答發(fā)生變化，而基于結(jié)構(gòu)構(gòu)象的疫苗設(shè)計(jì)可以應(yīng)用于RBD蛋白分子。根據(jù)MERS-CoV RBD蛋白晶體結(jié)構(gòu)及功能特點(diǎn)，選取4個(gè)在MERS-CoV RBD不同的獨(dú)立表位：Arg511、Ala562、Val403和Thr579。利用定點(diǎn)突變PCR方法在相應(yīng)位點(diǎn)形成N糖基化基序，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞293T中，分別表達(dá)并純化4種突變MERS-CoV RBD蛋白。利用SDS

13、-PAGE和質(zhì)譜分析的方法鑒定了糖基化的形成。利用AlphaScreen法和流式細(xì)胞法分析重組MERS-CoV RBD蛋白與人DPP4蛋白間的結(jié)合能力結(jié)果顯示，位于511位置的糖基化修飾可阻斷RBD蛋白與受體DPP4的結(jié)合。位于562位置的糖基化修飾可降低MERS-CoV RBD蛋白與受體DPP4的結(jié)合。而位于403和579位的糖基化則對(duì)RBD與DPP4之間的結(jié)合沒(méi)有影響。實(shí)驗(yàn)也分析了糖基化位點(diǎn)的引入對(duì)MERS-CoV RBD蛋白抗原性

14、變化（hMS-1，m336-Fab，m337-Fab和m338-Fab）。ELISA結(jié)果顯示，位于511位的糖基化突變完全阻斷了RBD蛋白與Mersmab1的結(jié)合，降低了MERS-CoV RBD蛋白對(duì)m336-Fab和 m337-Fab的結(jié)合。與511位不同，403,562和579位糖基化對(duì)MERS-CoV RBD蛋白與任意4種中和性單克隆抗體結(jié)合均無(wú)顯著影響。免疫原性及中和抗體分析顯示，與MERS-CoV RBD野生型蛋白相比，分別帶

15、有579和511位糖基化表位的MERS-CoV RBD蛋白，前者能夠顯著提高中和抗體滴度，而后者的中和抗體滴度則顯著降低。而分別帶有403和562位點(diǎn)糖基化的MERS-CoV RBD蛋白所誘導(dǎo)的中和抗體滴度與野生型相比則沒(méi)有顯著性差別，同時(shí)，在活病毒保護(hù)性評(píng)價(jià)中，得到相似結(jié)果。為定量地評(píng)價(jià)表位的中和免疫原性，我們提出一個(gè)新的“中和免疫原性指數(shù)”（NII）的概念，并定義其為，在某特定表位中，糖基化探針的出現(xiàn)或消失對(duì)免疫原誘導(dǎo)中和免疫效應(yīng)能

16、力的改變的比值。NII可以作為一個(gè)有效的評(píng)價(jià)手段定量地評(píng)價(jià)MERS-CoV RBD疫苗上特定表位，進(jìn)一步闡明免疫保護(hù)機(jī)制，從而指導(dǎo)MERS-CoV RBD疫苗的優(yōu)化設(shè)計(jì)。
　　總之，我們的研究在鑒定了MERS-CoV RBD蛋白誘導(dǎo)廣譜交叉性中和保護(hù)效果的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)RBD分子構(gòu)象性改造，及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的RBD分子修飾提高RBD亞單位疫苗的保護(hù)效果，對(duì)以結(jié)構(gòu)蛋白為靶點(diǎn)的抗病毒疫苗優(yōu)化設(shè)計(jì)提供重要評(píng)價(jià)方法，進(jìn)一步揭示了MERS-CoV