中東呼吸綜合征冠狀病毒受體結合區(qū)蛋白在昆蟲細胞中的重組表達與免疫保護作用研究.pdf

1、目的：
　　利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)重組表達MERS-CoV S1和RBD蛋白，明確其作為重組疫苗靶抗原的免疫原性和誘導中和抗體的能力；利用制備的S1重組蛋白篩選制備具有中和活性的抗MERS-CoV單克隆抗體。
　　方法：
　　（1）構建含有MERS-CoV S1基因的重組桿狀病毒質(zhì)粒，轉染SF9細胞包裝桿狀病毒。重組病毒傳代3次獲得種子病毒，感染Sf9細胞，收獲感染上清，通過鎳離子親和層析純化獲得S1重組蛋白。利用純

2、化的S1蛋白免疫BALB/c小鼠，通過ELISA檢測免疫小鼠血清抗原特異性的抗體水平；通過假病毒以及活病毒中和試驗檢測血清中抗體的中和活性。同時利用重組表達S1蛋白免疫BALB/c小鼠，將免疫后小鼠脾細胞與 SP2/0骨髓瘤細胞融合，通過ELISA篩選出陽性克隆，隨后通過多次亞克隆篩選出穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株，制備單抗腹水并進行抗體效價測定及亞類鑒定；通過MERS-CoV假病毒及活病毒中和試驗篩選出中和單抗。
　　（2）

3、利用生物信息學方法對MERS-CoVS1基因序列、二級結構、柔性分析；同時對MERS-CoV RBD、MERS-CoV單克隆抗體及MERS-CoV RBD與細胞受體DPP4結合的晶體結構進行分析預測在S1內(nèi)部具有免疫保護功能區(qū)段355-590aa；針對預測的免疫功能保護區(qū)設計添加foldon序列，構建含有MERS-CoV RBD、MERS-CoV RBD Fd基因的重組桿狀病毒質(zhì)粒，轉染SF9細胞包裝桿狀病毒。重組病毒傳代3次獲得種子病

4、毒進而感染Sf9細胞，收獲感染上清，通過鎳離子親和層析純化獲得 RBD、RBDFd重組蛋白。利用純化的重組蛋白免疫 BALB/c小鼠，通過ELISA檢測免疫小鼠血清抗原特異性的抗體水平；通過假病毒以及活病毒中和試驗檢測血清中抗體的中和活性。
　　結果：
　?。?）獲得了表達 MERS-CoV S1蛋白的重組病毒株，并在昆蟲細胞中成功表達和純化了分子量約140kD S1重組蛋白。利用重組表達的S1蛋白免疫小鼠三次，血清S1特異

5、性IgG抗體滴度可達1:102400；免疫小鼠血清稀釋5120倍后中和百分比仍能達到50％以上，且具有良好的活病毒中和活性。
　?。?）利用重組的MERS-CoV S1蛋白篩選獲得了10株能夠穩(wěn)定分泌抗原特異性單抗的雜交瘤細胞株。制備的腹水單抗亞類為6株為 IgG1型，2株為IgG2a型，2株為IgM型；10株單抗抗體ELISA效價達到10000以上，并獲得1株單抗對MERS-CoV具有良好的中和活性。
　　（3）獲得了表達

6、MERS-CoV RBD、MERS-CoV RBD Fd蛋白的重組病毒株，在昆蟲細胞中成功表達并純化了分子量約40kD MERS-CoV RBD單體重組蛋白以及分子量約100kD MERS-CoV RBDFd寡聚體蛋白。利用重組表達的RBD單體蛋白免疫小鼠三次，血清MERS-CoV RBD特異性IgG抗體滴度可達1:6400；免疫小鼠血清稀釋3200倍后中和百分比低于50%，對MERS-CoV假病毒的中和活性較弱。而利用形成寡聚體的RB

7、D蛋白在一次加強免疫后，血清中MERS-CoV RBDFd特異性IgG抗體滴度可達1:102400；免疫小鼠血清稀釋12800倍后中和百分比仍高于50%。
　　結論：
　　利用昆蟲細胞重組表達的MERS-CoV S1蛋白具有良好的免疫原性，并能夠有效誘導產(chǎn)生高滴度保護性中和抗體，篩選制備出一株具有良好中和活性的MERS-CoV單克隆抗體。重組表達的MERS-CoV RBD單體蛋白免疫原性以及對假病毒中和活性都較弱；利用昆蟲細