阿霉素和白藜蘆醇共遞送PLGA納米粒的制備及其抗腫瘤活性評(píng)價(jià).pdf

1、目的：
　　阿霉素（doxorubicin，DOX）對(duì)乳腺癌等腫瘤療效確切，價(jià)格低廉，但其毒副作用顯著，而且腫瘤細(xì)胞易對(duì)DOX產(chǎn)生耐藥，成為DOX臨床應(yīng)用最常見(jiàn)和難以克服的問(wèn)題。本研究以聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）為內(nèi)核，采用茴香酰胺-聚乙二醇-膽固醇連接物（AA-PEG-hyd-CHOL）對(duì)PLGA納米粒進(jìn)行修飾，并將DOX和白藜蘆醇（resveratrol，RES）共同包封于PLGA納米粒中，得到阿霉素和白藜蘆醇共遞送P

2、LGA納米粒（NPS），使DOX和RES在體內(nèi)具有腫瘤靶向性，延長(zhǎng)DOX和RES在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，克服腫瘤細(xì)胞對(duì)DOX的耐藥，增強(qiáng)DOX的抗腫瘤作用，同時(shí)降低DOX對(duì)正常組織的毒性。
　　方法：
　　1.采用乳化溶劑揮發(fā)法制備表面修飾 AA-PEG-hyd-CHOL的共同包封 DOX和RES的PLGA納米粒（NPS），并用納米粒度及zeta電位分析儀和透射電鏡對(duì)納米粒進(jìn)行表征。
　　2.采用熒光分光光度法研究NPS在不

3、同pH（pH5.0，pH6.5和pH7.4）緩沖液中釋放DOX和RES的動(dòng)力學(xué)。
　　3.采用MTT實(shí)驗(yàn)研究NPS、DOX、RES以及DOX和RES混合溶液（MIX）對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞、MDA-MB-231/ADR細(xì)胞和MCF-7/ADR細(xì)胞的細(xì)胞毒性；通過(guò)試劑盒檢測(cè) NPS、DOX、RES以及 MIX對(duì) MDA-MB-231/ADR細(xì)胞和MCF-7/ADR細(xì)胞中Caspase-3活性的影響。
　　4.通過(guò)激光共聚焦

4、顯微鏡觀察 MDA-MB-231/ADR細(xì)胞和 MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)NPS、DOX、RES以及MIX的攝取，并觀察DOX和RES在MDA-MB-231/ADR細(xì)胞和MCF-7/ADR細(xì)胞內(nèi)的分布。
　　5.采用流式細(xì)胞術(shù)以及 Western blot檢測(cè) NPS、DOX、RES以及 MIX對(duì)MDA-MB-231/ADR細(xì)胞和MCF-7/ADR細(xì)胞細(xì)胞周期以及周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　6.采用Western blot檢

5、測(cè)NPS、DOX、RES以及MIX對(duì)MDA-MB-231/ADR細(xì)胞和MCF-7/ADR細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白以及耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　7.采用MTT實(shí)驗(yàn)研究NPS、DOX、RES以及MIX對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性；采用Western blot檢測(cè)NPS、DOX、RES以及MIX對(duì)A549細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　8.復(fù)制裸鼠MDA-MB-231/ADR細(xì)胞移植瘤模型，以腫瘤體積為指標(biāo)，觀察NPS、D

6、OX、RES的體內(nèi)抗腫瘤活性。采用活體成像儀觀察NPS遞送DOX和RES在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布，采用熒光顯微鏡觀察NPS遞送DOX和RES在正常器官組織和腫瘤組織切片中的分布。對(duì)組織切片進(jìn)行 H&E染色，觀察 NPS、DOX、RES對(duì)正常器官組織以及腫瘤組織形態(tài)的影響。對(duì)腫瘤組織內(nèi)的蛋白進(jìn)行提取，觀察NPS對(duì)腫瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白以及耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　9.復(fù)制裸鼠A549細(xì)胞移植瘤模型，以腫瘤體積為指標(biāo)，觀察NPS、DO

7、X、RES的體內(nèi)抗腫瘤活性。采用活體成像儀觀察NPS遞送DOX和RES在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布，采用熒光顯微鏡觀察NPS遞送DOX和RES在正常器官組織和腫瘤組織切片中的分布。對(duì)組織切片進(jìn)行 H&E染色，觀察 NPS、DOX、RES對(duì)正常器官組織以及腫瘤組織形態(tài)的影響。
　　結(jié)果：
　　1. NPS的平均粒徑為（204±27）nm，zeta電位為（-15.8±0.8）mV，DOX和RES的載藥量分別為（4.6±1.4）％和（15

8、.5±5.3）%。
　　2. NPS釋放DOX和RES呈pH依賴性，當(dāng)孵育時(shí)間為24h時(shí)，NPS在pH5.0的緩沖液中，DOX和RES的累積釋藥量分別達(dá)到了67.7%和81.4%；在pH7.4的緩沖液中，DOX和RES的累積釋藥量只有43.7%和43.6%。
　　3. NPS可劑量依賴性地抑制 MDA-MB-231細(xì)胞、MDA-MB-231/ADR細(xì)胞和MCF-7/ADR細(xì)胞的生長(zhǎng)；NPS可濃度依賴性地增加 MDA-MB-2

9、31/ADR細(xì)胞和MCF-7/ADR細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的水平。
　　4. NPS可時(shí)間依賴性地增加 DOX和 RES在 MDA-MB-231/ADR細(xì)胞和MCF-7/ADR細(xì)胞核內(nèi)的蓄積。
　　5. NPS能夠顯著降低MDA-MB-231/ADR細(xì)胞和MCF-7/ADR細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin D1、CDK2以及CDK4的表達(dá)，誘導(dǎo)MDA-MB-231/ADR細(xì)胞和MCF-7/ADR細(xì)胞發(fā)生G1期

10、阻滯。
　　6.NPS可顯著降低MDA-MB-231/ADR細(xì)胞和MCF-7/ADR細(xì)胞中耐藥相關(guān)蛋白P-gp、MRP-1和BCRP的表達(dá)。此外，NPS還能夠顯著降低MDA-MB-231/ADR細(xì)胞和MCF-7/ADR細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白NF-κB和BCL-2的表達(dá)，并且上調(diào)Bax的表達(dá)。
　　7. NPS可劑量依賴性地抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，顯著降低A549細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin D1、CDK2以及

11、CDK4的表達(dá)，使細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯。此外， NPS能夠顯著降低A549細(xì)胞中NF-κB和BCL-2蛋白的表達(dá)，并且上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)。
　　8. NPS可劑量依賴性地抑制裸鼠 MDA-MB-231/ADR細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)。NPS可有效遞送RES和DOX于MDA-MB-231/ADR細(xì)胞移植瘤組織中，并減少RES和DOX在其他正常器官組織中的蓄積，尤其是DOX在心臟組織中的蓄積。H&E染色結(jié)果表明，NPS可顯著降低DOX的心臟毒

12、性。Western blot結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，NPS可顯著降低腫瘤組織P-gp、BCRP、MRP-1、BCL-2以及NF-κB的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Bax和Caspase-3的表達(dá)。
　　9. NPS可有效遞送RES和DOX于A549細(xì)胞移植瘤組織中，劑量依賴性地抑制裸鼠A549細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)，減少RES和DOX在正常器官組織中的蓄積，尤其是DOX在心臟組織中的蓄積。H&E染色結(jié)果表明，NPS可顯著降低DOX的心臟毒性。