MiR--4521負(fù)調(diào)控FAM129A促進(jìn)ccRCC進(jìn)展及機(jī)制研究.pdf

1、腎細(xì)胞癌(Renal Cell Carcinoma，RCC)是起源于腎小管上皮絀胞的惡性腫瘤，是最常見的腎癌類型，約占人類惡性腫瘤的3％，占所有腎癌的85％。RCC是多年來我國泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，并且發(fā)病率在持續(xù)增長。腎透明細(xì)胞癌(clear cell Renal Cell Carcinoma，ccRCC)是最常見、最具侵襲性的RCC亞型，約占RCC的80％，具有極高的局部侵襲性、死亡率以及對化療和放療的耐藥性。miR-452

2、1在多種惡性腫瘤和疾病中異常表達(dá)，目前鮮有對其機(jī)制的研究。FAM129A的異常表達(dá)與多種腫瘤密切相關(guān)。FAM129A高表達(dá)促進(jìn)了甲狀腺腫瘤侵襲及甲狀腺結(jié)節(jié)的增生，是甲狀腺腫瘤以及鑒別良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的一個(gè)潛在的生物標(biāo)志分子。但miR-4521與FAM129A在ccRCC進(jìn)展中的研究尚無報(bào)道。
　　目的：1.研究ccRCC患者樣本及ccRCC細(xì)胞系中miR-4521，F(xiàn)AM129A表達(dá)水平以及二者相關(guān)性;2.探討miR-4521與F

3、AM129A在ccRCC中的靶向負(fù)調(diào)控關(guān)系;3.研究miR-4521過表達(dá)對786-O、ACHN細(xì)胞生物學(xué)行為影響及作用機(jī)制;4.研究FAM129A敲降對786-O、ACHN細(xì)胞生物學(xué)行為影響及作用機(jī)制。
　　方法：1.qRT-PCR法檢測miR-4521，F(xiàn)AM129A在55例配對ccRCC臨床樣本中表達(dá)水平;WB法檢測FAM129A在37例配對ccRCC臨床樣中的表達(dá)情況;免疫組織化學(xué)(IHC)法檢測FAM129A在30例配對

4、ccRCC臨床樣中的表達(dá)情況及在細(xì)胞中的定位。2.qRT-PCR檢測miR-4521和FAM129A在正常腎上皮細(xì)胞HK-2和腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O及ACHN中的表達(dá)情況。3.在786-O和ACHN細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-4521，qRT-PCR法檢測miR-4521上調(diào)效率;qRT-PCR法和WB法檢測miR-4521過表達(dá)及FAM129A的表達(dá)水平。4.通過miRNA預(yù)測軟件(TargetS can，microRNA.org

5、)分析miR-4521與FAM129A間靶向關(guān)系;將重組雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體分別與miR-4521mimic和NC mimic共轉(zhuǎn)染至786-O細(xì)胞中，檢測雙熒光素酶熒光強(qiáng)度值。5.MTT法檢測miR-4521過表達(dá)后對786-O和ACHN細(xì)胞增殖能力的影響;Transwell法檢測miR-4521過表達(dá)后對786-O和ACHN細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響;流式細(xì)胞儀分析法檢測miR-4521過表達(dá)對786-O和ACHN細(xì)胞凋亡的影響

6、;WB法檢測miR-4521上調(diào)后TIMP-1，MMP2，MMP9，MDM2，P53，Bcl2，Bax的表達(dá)情況。6MTT法檢測FAM129A敲降后對786-O和ACHN增殖能力的影響;Transwell法檢測FAM129A敲降后對786-O和ACHN遷移和侵襲能力的影響;流式細(xì)胞儀分析法檢測FAM129A敲降后對786-O和ACHN凋亡的影響;WB法檢測FAM129A敲降后TIMP-1，MMP2，MMP9，MDM2，P53，Bcl2，

7、Bax的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1.與正常組織相比，miR-4521在ccRCC組織中低表達(dá)，且表達(dá)水平隨TNM分期和Furhman分級負(fù)相關(guān)性明顯;與正常組織相比，在ccRCC組織中FAM129A的mRNA和蛋白水平都呈高表達(dá)，其表達(dá)水平隨著TNM分期和Furhman分級的升高而升高;在ccRCC樣本中，miR-4521和FAM129A的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（P=0.0001）;FAM129A主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。2.與正常腎上皮細(xì)胞H

8、K-2相比，miR-4521在ccRCC細(xì)胞786-O與ACHN中低表達(dá)，F(xiàn)AM129A在786-O與ACHN中高表達(dá)，其結(jié)果與臨床樣本結(jié)果一致。3.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-4521mimic后，miR-4521在786-O與ACHN細(xì)胞中分別上調(diào)1820倍（P=0.01）和920(P=0.02)倍;同時(shí)，F(xiàn)AM129A在mRNA和蛋白水平相對于NC mimic組明顯降低。4.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，在重組雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體突變型組

9、中，NC mimic組與miR-4521mimic組的雙熒光素酶檢測活性無明顯差異，但野生型組中，與NC mimic相比，miR-4521mimic組的檢測活性相對于NCmimic組降低38.2％（P=0.001）;5.miR-4521過表達(dá)抑制786-O與ACHN細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲，促進(jìn)了786-O與ACHN細(xì)胞的凋亡;同時(shí)TIMP-1，P53和Bax的表達(dá)水平升高，而MMP2，MMP9，MDM2和Bcl2表達(dá)水平降低。6.FAM

10、129低表達(dá)抑制786-O與ACHN細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲，促進(jìn)了786-O與ACHN細(xì)胞的凋亡;同時(shí)TIMP-1，P53和Bax的表達(dá)水平升高，而MMP2，MMP9，MDM2和Bcl2表達(dá)水平降低。
　　結(jié)論：1.miR-4521在患者組織中表達(dá)水平降低與ccRCC臨床進(jìn)展相關(guān);FAM129A在患者組織中表達(dá)水平升高與ccRCC臨床進(jìn)展相關(guān);FAM129A主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中;miR-4521與FAM129A在ccRCC患者組織及

11、ccRCC細(xì)胞株中表達(dá)水平負(fù)相關(guān)性明顯。2.過表達(dá)miR-4521抑制FAM129A在ccRCC細(xì)胞中的表達(dá);miR-4521靶向結(jié)合FAM129A基因的3'-UTR區(qū)，進(jìn)而負(fù)調(diào)控FAM129A表達(dá)。3.miR-4521過表達(dá)通過促進(jìn)TIMP-1表達(dá)，降低MMP2，MMP9表達(dá)，進(jìn)而降低786-O和ACHN細(xì)胞的體外增殖和遷移侵襲能力;miR-4521過表達(dá)降低MDM2表達(dá)促進(jìn)P53表達(dá)，而Bcl2水平降低，Bax水平升高促進(jìn)786-O