超高靈敏流式分析技術(shù)在病毒納米顆粒多參數(shù)定量表征中的應(yīng)用.pdf

1、病毒是自然界中分布最廣、基因多樣性最強(qiáng)的生命形式，同時它也是許多致死性疾病的罪魁禍?zhǔn)?。歷史上各種傳染性病毒如流感病毒、天花、埃博拉病毒的肆虐給人類帶來了巨大的災(zāi)難;動物病毒和植物病毒感染造成畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)的巨額經(jīng)濟(jì)損失;一些病毒甚至被制成生化武器，對人類的生命安全和社會安定產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。另一方面，病毒作為病原體的廣泛研究使人們對其生物遺傳信息有了詳細(xì)的了解，病毒具備良好的生物相容性和穩(wěn)定性，其尺寸微小(20-200 nm)、生長繁殖迅速、

2、容易大規(guī)模生產(chǎn)且基因改造相對容易，可以通過化學(xué)或基因工程的方法進(jìn)行修飾，使其發(fā)揮特定的功能，如作為醫(yī)學(xué)診斷和治療的試劑、基因傳遞的載體及抗菌劑等。
　　病毒顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)，如粒徑、濃度、化學(xué)組成以及功能性分子的包裹效率等，直接影響其作用效果。雖然透射電子顯微鏡(Transmission electronmicroscopy, TEM)存在操作繁瑣、耗時，價格昂貴等缺點(diǎn)，且難以提供具有統(tǒng)計(jì)代表性的量化信息，它依然是觀察病毒顆粒的

3、粒徑和形貌最常用的方法。傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法和半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)的方法是兩種經(jīng)典的病毒濃度測定方法，但是它們只適用于具有侵染活性并能產(chǎn)生明顯細(xì)胞破損的病毒的計(jì)數(shù)，不適用于沒有侵染活性的病毒樣顆粒的分析。發(fā)展快速、靈敏、通用的病毒顆粒表征分析方法對病毒納米技術(shù)的推廣和發(fā)展至關(guān)重要。
　　流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry, FCM）是一種對懸液中單個細(xì)胞或細(xì)胞大小的顆粒進(jìn)行快速定量表征的先進(jìn)技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞尺寸

4、、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、核酸以及蛋白質(zhì)等物理、化學(xué)以及遺傳性質(zhì)等多參數(shù)的同時測定。病毒個體微小，結(jié)構(gòu)簡單，攜帶的生物分子相對較少，由于檢測靈敏度的限制，傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀難以在單顆粒水平對病毒進(jìn)行測定。我們課題組于2009年研制成功具有單分子檢測能力的雙通道超高靈敏流式檢測裝置(High sensitivity flow cytometer,HSFCM)，隨后又于2012年研制成功第二代超高靈敏流式檢測裝置，在檢測性能方面較傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀已經(jīng)有了質(zhì)的

5、飛躍，能夠檢測到單個24 nm的二氧化硅納米顆粒和7nm的納米金顆粒的散射光信號，散射檢測靈敏度較傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀提升了4-5個數(shù)量級，可在單顆粒水平對天然生物納米顆粒進(jìn)行快速的高分辨表征，對于推動納米科技、生物醫(yī)藥的發(fā)展以及基礎(chǔ)生命科學(xué)研究具有重要意義。
　　本論文將利用HSFCM的超高靈敏度和多參數(shù)檢測特性，建立一種在單顆粒水平對病毒進(jìn)行快速檢測分析的方法，實(shí)現(xiàn)病毒顆粒的尺寸、生化性能、濃度等性狀的多參數(shù)定量表征，為生物醫(yī)學(xué)和生

6、化分析提供一個強(qiáng)有力的手段。本論文主要包括以下幾個方面的內(nèi)容:
　　第一章為文獻(xiàn)綜述。主要介紹病毒納米顆粒的重要應(yīng)用和新近發(fā)展的單個病毒納米顆粒分析技術(shù)，以及本論文的選題思路和研究內(nèi)容。
　　第二章為病毒及其混合物的單顆粒水平無標(biāo)記檢測。通過提高激光功率密度和進(jìn)一步降低探測區(qū)體積等策略，實(shí)現(xiàn)了對粒徑只有27 nm的輕小病毒MS2的單顆粒檢測，該檢測靈敏度能夠滿足自然界中絕大多數(shù)病毒的檢測需求。HSFCM具備卓越的散射光檢測性

7、能，基于散射光強(qiáng)度的差異，能夠分辨不同家族的病毒顆?；旌衔?，同時也可以區(qū)分粒徑相似而內(nèi)含物不同的病毒顆粒載體。根據(jù)Rayleigh散射定律，顆粒的散射光強(qiáng)度與顆粒的粒徑和折射率有關(guān)，當(dāng)選用折射率與病毒顆粒相近的二氧化硅納米顆粒作為粒徑標(biāo)準(zhǔn)品時，通過HSFCM測定幾種粒徑已知的二氧化硅納米顆粒的散射光強(qiáng)度，繪制散射光強(qiáng)度與粒徑的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，即可獲得病毒顆粒的粒徑分布信息。HSFCM實(shí)現(xiàn)了對病毒粗提混合物的高分辨表征，同時可用于組分的快速

8、定量分析。HSFCM在一分鐘的時間內(nèi)可對成千上萬個病毒顆粒進(jìn)行快速的逐一分析，分辨率可與電鏡相媲美，檢測速度更快，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)代表性更強(qiáng)，而且懸液分析有利于保持樣品的天然狀態(tài)。
　　第三章為病毒顆粒的散射、熒光雙參數(shù)檢測。病毒是一種很有發(fā)展前景的藥物載體，但是缺少有效的表征手段直接限制了其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的發(fā)展。HSFCM的散射和熒光雙參數(shù)同時檢測能力，可實(shí)現(xiàn)熒光標(biāo)記的病毒納米顆粒內(nèi)部包裹的基因組和表面的蛋白質(zhì)分子的表征，得到樣品顆粒的

9、分布信息。我們通過核酸標(biāo)記分析病毒基因組釋放的結(jié)果，并對其釋放過程進(jìn)行動態(tài)監(jiān)控，進(jìn)一步對海水等復(fù)雜體系中的病毒進(jìn)行熒光標(biāo)記及散射、熒光雙參數(shù)的分析，建立了一種病毒納米顆粒混合物的多參數(shù)表征方法。該方法操作簡單、檢測時間短、需要的樣品量少，為病毒納米技術(shù)的發(fā)展、納米藥物研究以及生物地球化學(xué)循環(huán)提供一種有效的表征手段。
　　第四章為病毒納米顆粒的計(jì)數(shù)及濃度定量分析。在HSFCM檢測中，由于樣品流的直徑小于激光光斑，經(jīng)過探測區(qū)的樣品顆粒

10、被逐一檢測，檢測效率接近100％?；趩晤w粒計(jì)數(shù)，我們發(fā)展了病毒納米顆粒濃度的定量分析方法，與傳統(tǒng)的空斑計(jì)數(shù)法具有良好的一致性，此方法還可以用于無侵染活性的病毒樣顆粒的定量分析，相比于空斑計(jì)數(shù)法通用性更強(qiáng)。此外，結(jié)合熒光染色的方法，利用HSFCM散射和熒光同時檢測的性能，實(shí)現(xiàn)了血漿中病毒的檢測和濃度定量表征，為臨床病毒檢測和監(jiān)控提供一種新的方法。HSFCM對病毒納米顆粒的定量分析方法操作簡單、檢測速度快、準(zhǔn)確性高，通用性廣，適用于不同種