慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的青年雄性抑郁大鼠的腦蛋白質(zhì)組學(xué)研究及大黃素干預(yù).pdf

1、本文分為以下兩個部分進行探討：
　　第一部分 慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁大鼠和應(yīng)激抵抗大鼠腦蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　目的：
　　研究慢性不可預(yù)測溫和應(yīng)激（CUMS）誘導(dǎo)的大鼠的不同行為學(xué)表現(xiàn)及海馬內(nèi)不同變化。通過蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析各組海馬組織，力圖發(fā)現(xiàn)與抑郁和應(yīng)激抵抗相關(guān)的差異蛋白及生物過程，揭示針對應(yīng)激發(fā)生不同反應(yīng)的可能的分子機制。
　　方法：
　　選取8周齡的SD大鼠，每日隨機給予大鼠以下刺激中的2-3種，包括：禁

2、食（24 h）、禁水（24 h），群居（每4-5只飼養(yǎng)在一個小鼠籠內(nèi)，12 h）、傾斜鼠籠（16 h）、鼠籠環(huán)境潮濕（將200 ml的水倒入鼠籠）、白噪音刺激（85 dB，6 h）、空瓶子（2 h）、熱刺激（45 oC，15 min）、冷刺激（4 oC，2 h）、持續(xù)光照（12 h）和閃光燈刺激（200 Hz，4 h），持續(xù)7周。刺激前后均用糖水偏好實驗、強迫游泳實驗、曠場實驗評價大鼠的行為狀態(tài)。根據(jù)行為學(xué)表現(xiàn)，應(yīng)激后分為三組，正常對照

3、組、應(yīng)激抵抗組、應(yīng)激敏感組（即抑郁組）。采用尼氏染色和高爾基染色分別檢測海馬神經(jīng)元的數(shù)目和海馬神經(jīng)元的樹突棘。通過免疫組化方法研究小膠質(zhì)細胞的形態(tài)，并進行體視學(xué)分析。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定海馬內(nèi)促炎因子的水平。檢測海馬組織脂質(zhì)氧化指標（丙二醛）和抗氧化酶（超氧化物歧化酶）的水平和活性。采用基于 iTRAQ技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析各組海馬組織，篩選出差異表達蛋白；對差異蛋白進行生物學(xué)分析：GO注釋及GO富集分析，尋找與差異表

4、達蛋白顯著相關(guān)的生物學(xué)過程。然后采用免疫印跡、免疫組織化學(xué)、免疫熒光的方法對相關(guān)蛋白及生物學(xué)過程進行驗證及進一步深入研究。
　　結(jié)果：
　　1.抑郁組的大鼠糖水消耗百分比下降到45％，而對照組和應(yīng)激抵抗組仍為80%以上；抑郁組的大鼠在水中靜止不動的時間為220 s，明顯高于對照組的78 s和應(yīng)激抵抗組的82 s；抑郁組大鼠5 min內(nèi)穿越的格子數(shù)目約30個，這明顯低于對照組的149個和應(yīng)激抵抗組的138個，抑郁組大鼠的雙上肢

5、垂直上抬的次數(shù)下降至8次，少于對照組的27和應(yīng)激抵抗組的26；以上結(jié)果，抑郁組大鼠表現(xiàn)出明顯的抑郁樣行為，但是應(yīng)激抵抗組大鼠并未表現(xiàn)出抑郁樣行為。
　　2.尼氏染色結(jié)果顯示抑郁組海馬CA1、CA3、DG區(qū)神經(jīng)元面積較對照組均下降30%左右，而應(yīng)激抵抗組與對照組相比沒有差異。海馬樹突棘研究結(jié)果顯示，抑郁組大鼠海馬CA1區(qū)的樹突棘和成熟的蘑菇型樹突棘分別為4.3個/10μm、1.7個/50μm，對照組的分別為10.7個/10μm、6.

6、7個/50μm，應(yīng)激抵抗組分別為10個/10μm、6.3個/50μm，表明抑郁組大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)目及其樹突棘數(shù)目下降，應(yīng)激抵抗組沒有發(fā)生神經(jīng)元及其樹突棘的丟失。
　　3.小膠質(zhì)細胞形態(tài)學(xué)研究結(jié)果顯示，抑郁組海馬區(qū)三種狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞所占百分比分別為靜息態(tài)16.4%、中間態(tài)35.2%、激活態(tài)48.4%，對照組則分別為靜息態(tài)68.7%、中間態(tài)24.3%、激活態(tài)7%，而應(yīng)激抵抗組為靜息態(tài)45.2%、中間態(tài)45.8%、激活態(tài)9%。抑郁組海

7、馬區(qū)處于激活態(tài)的小膠質(zhì)細胞高于另外兩組，而應(yīng)激抵抗組的海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞更多的是處于中間態(tài)。
　　4. ELISA結(jié)果顯示，對照組海馬IL-1β、TNF-α的水平分別為50.8 pg/mg蛋白，26.2 pg/mg蛋白，應(yīng)激抵抗組分別為48.7 pg/mg蛋白，24.1 pg/mg蛋白，抑郁組分別為108.4 pg/mg蛋白，56.4 pg/mg蛋白，明顯高于對照組和應(yīng)激抵抗組。
　　5.氧化應(yīng)激指標檢測結(jié)果顯示，對照組海馬丙

8、二醛的水平為0.41 nmol/mg蛋白，應(yīng)激抵抗組為0.37 nmol/mg蛋白，抑郁組為0.76 nmol/mg蛋白，明顯高于對照組和應(yīng)激抵抗組；對照組海馬超氧化物歧化酶的活性為100.8 U/mg蛋白，應(yīng)激抵抗組為151.2 U/mg蛋白，高于對照組，抑郁組為62.5 U/mg蛋白，明顯低于對照組和應(yīng)激抵抗組。
　　結(jié)論：
　　CUMS后，抑郁組的大鼠海馬內(nèi)許多蛋白水平發(fā)生異常變化，這些蛋白的異常變化可能介導(dǎo)了突觸可塑

9、性、炎癥過程、氧化應(yīng)激、信號通路、物質(zhì)轉(zhuǎn)運等相關(guān)生物學(xué)過程的異常，使海馬內(nèi)出現(xiàn)顯著的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致海馬神經(jīng)元數(shù)目及其樹突棘數(shù)目下降、星形膠質(zhì)細胞可塑性降低等，最終引起抑郁樣行為的發(fā)生。CUMS后，應(yīng)激抵抗的大鼠海馬內(nèi)同樣存在一些蛋白水平發(fā)生變化，這些蛋白可能參與了一系列的生物過程的調(diào)控，比如增強氧化磷酸化作用及抗氧化應(yīng)激能力，使得星形膠質(zhì)細胞可塑性增強，炎癥反應(yīng)受到抑制，神經(jīng)元未發(fā)生異常病變，從而成功抵制了抑郁樣行為的

10、發(fā)生。
　　第二部分 大黃素改善抑郁的腦保護機制
　　目的：
　　研究大黃素對于慢性不可預(yù)測溫和應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁樣行為的治療作用，并探索其作用機制。
　　方法：
　　采用CUMS制造抑郁模型，5周后通過糖水偏好實驗篩選出有抑郁傾向的大鼠，然后給予大黃素灌胃治療兩周，每日劑量為80 mg/kg，給藥的過程中應(yīng)激同前，兩周之后，對各組大鼠進行行為學(xué)檢測，評價其抑郁狀態(tài)。采用尼氏染色檢測海馬神經(jīng)元，采用高爾基染色檢

11、測海馬神經(jīng)元的樹突棘。通過免疫組化檢測小膠質(zhì)細胞的形態(tài)學(xué)變化，并進行體視學(xué)分析。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定海馬內(nèi)促炎因子的水平，檢測海馬組織脂質(zhì)氧化指標MDA和抗氧化酶（SOD）的水平和活性。采用免疫印跡、免疫組化、免疫熒光實驗，檢測 Nrf2及其磷酸化水平變化，檢測 GSK3β，PI3K/AKT的變化，檢測5-LO的水平變化。采用熒光定量 PCR的方法檢測 miR495，miR139-5p， miR135-5p，miR126-3p的水平變

12、化。
　　結(jié)果：
　　1.大黃素干預(yù)的抑郁傾向組糖水消耗百分比為78.5%，較載體干預(yù)的抑郁傾向組明顯升高，且與正常對照組相比沒有差異。大黃素干預(yù)的抑郁傾向組在水中靜止不動的時間為79 s，明顯低于載體干預(yù)的抑郁傾向組的206 s，且與正常對照組相比沒有差異。大黃素干預(yù)的抑郁傾向組大鼠5 min內(nèi)穿越的格子數(shù)目約124個，這明顯高于載體干預(yù)的抑郁傾向組25個，且與正常對照組相比沒有差異；同時大黃素干預(yù)的抑郁傾向組大鼠的雙上肢

13、垂直上抬的次數(shù)為約22次，這明顯高于載體干預(yù)的抑郁傾向組的8次，且與正常對照組對比沒有差異。
　　2.尼氏染色結(jié)果顯示，與載體干預(yù)的抑郁傾向組相比，大黃素干預(yù)的抑郁傾向組的海馬CA1、CA3、DG區(qū)神經(jīng)元面積分別增加了25%、19%、22%，且均與正常對照組對比無差異。高爾基染色結(jié)果顯示，大黃素干預(yù)的抑郁傾向組的海馬 CA1區(qū)的樹突棘和成熟的蘑菇型樹突棘分別為8.3個/10μm、4個/50μm，明顯高于載體干預(yù)的抑郁傾向組的4.3

14、個/10μm、2個/50μm，但仍均低于正常對照組。
　　3.小膠質(zhì)細胞形態(tài)學(xué)研究結(jié)果顯示，載體干預(yù)的抑郁傾向組海馬區(qū)三種狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞所占百分比分別為靜息態(tài)16.4%、中間態(tài)35.2%、激活態(tài)48.4%，而大黃素干預(yù)的抑郁傾向組的分別為靜息態(tài)56.6%、中間態(tài)28.8%、激活態(tài)14.6%，可見大黃素干預(yù)后可明顯升高靜息態(tài)的比例和降低激活態(tài)的比例，但其中間態(tài)的比例仍高于正常對照組。
　　4. ELISA結(jié)果顯示，載體干預(yù)的

15、抑郁傾向組海馬 IL-1β、TNF-α的水平分別為110.1 pg/mg蛋白，55.1 pg/mg蛋白，而大黃素將其分別降低到60.5 pg/mg蛋白、32.9 pg/mg蛋白，這表明大黃素可以明顯降低慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的海馬炎癥因子水平的升高。氧化應(yīng)激指標顯示，大黃素干預(yù)的抑郁傾向組的海馬組織的 MDA水平為0.39 nmol/mg蛋白，SOD活性為90.7 U/mg蛋白，而載體干預(yù)的抑郁傾向組分別為0.73 nmol/mg蛋白，61.2

16、U/mg蛋白，表明大黃素可以有效改善氧化與抗氧化之間的失衡。
　　5.免疫印跡實驗結(jié)果表明，與載體干預(yù)的抑郁傾向組相比，大黃素干預(yù)的抑郁傾向組海馬全細胞p-Nrf2水平升高了157%，且比正常對照組也升高了100%。成分蛋白實驗結(jié)果提示，正常情況下，t-Nrf2在細胞漿和細胞核中均有分布，而p-Nrf2幾乎全部分布在細胞核中。慢性應(yīng)激后，載體干預(yù)的抑郁傾向組海馬組織的細胞漿內(nèi)的t-Nrf2水平升高，細胞核內(nèi)的t-Nrf2水平降低，

17、而大黃素干預(yù)后可使細胞漿和細胞核內(nèi)的t-Nrf2均恢復(fù)到正常水平，同時p-Nrf2在載體干預(yù)的抑郁傾向組細胞核內(nèi)水平明顯下降，而大黃素干預(yù)后，不僅可以增加細胞核內(nèi)p-Nrf2水平，且高于正常對照組。同時，腦片免疫組化染色結(jié)果顯示，大黃素干預(yù)后p-Nrf2在海馬CA1，CA3，DG區(qū)的表達量增加，其中 CA1區(qū)增加最為明顯，且高于正常對照組。免疫熒光雙標實驗結(jié)果顯示，p-Nrf2主要分布在神經(jīng)元內(nèi)，大黃素干預(yù)的抑郁傾向組較載體干預(yù)的抑郁傾

18、向組海馬CA1，CA3，DG區(qū)表達明顯增加，且?guī)缀跞糠植技毎藘?nèi)。
　　結(jié)論：
　　大黃素可以通過激活PI3K/AKT信號通路抑制應(yīng)激后GSK3β的過度激活，進而促進 Nrf2能發(fā)揮正常的抗氧化應(yīng)激作用，同時大黃素還可以通過上調(diào) miR495和miR139-5p來逆轉(zhuǎn)慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的5-LO活性和水平升高，進而抑制應(yīng)激后的炎癥反應(yīng)?？傊?，大黃素可以通過對異常的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的抑制，顯著改善海馬神經(jīng)元及其樹突棘的丟失，