慢性房顫心房重構(gòu)及蛋白質(zhì)組學(xué)的實驗研究.pdf

1、心房顫動(簡稱房顫)是臨床上十分常見的一種心律失常，其發(fā)病率隨著年齡的增長而增加，其主要臨床危害是增加血栓栓塞的危險，有著很高的致殘率，而且長期快速的心室反應(yīng)可導(dǎo)致心動過速性心肌病，甚至引發(fā)惡性室性心律失常，危及生命。目前認為房顫的發(fā)生和維持與多發(fā)子波折返、局灶觸發(fā)驅(qū)動、心房電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)以及神經(jīng)體液因子的變化等有關(guān)，是多種機制共同作用的結(jié)果，其中最為根本的是心房的電重構(gòu)及結(jié)構(gòu)重構(gòu)，即心房肌細胞的電生理特性及相關(guān)蛋白質(zhì)發(fā)生了變化，但是

2、其具體的發(fā)生機制仍未完全闡明，需要進一步研究。房顫的發(fā)生及轉(zhuǎn)歸離不開機體整個內(nèi)環(huán)境的改變，特別是機體中各種功能蛋白質(zhì)的變化，房顫的發(fā)生和維持歸根結(jié)底是機體中多種蛋白質(zhì)共同作用的結(jié)果。目前的研究多局限于單一或少數(shù)幾種基因或蛋白質(zhì)的變化，未能從整體上去把握其全貌。蛋白質(zhì)組的概念是指基因組所表達的全部蛋白質(zhì)，更為清楚的表述是細胞、組織或機體在特定的時間和空間上基因組活躍表達的蛋白質(zhì)。其中具有重要意義的疾病蛋白質(zhì)組學(xué)研究，主要是通過比較和分析正

3、常與異常組織細胞、同一疾病不同發(fā)展時期細胞內(nèi)整體蛋白質(zhì)的表達差異，對差異表達的蛋白質(zhì)進行鑒定、定量、表征，尋找與疾病相關(guān)的新標志物，為人類疾病研究提供新的手段和依據(jù)，還可以作為治療和藥物開發(fā)的靶點。蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)為二維電泳、質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)，目前已具備高通量分析和鑒定蛋白質(zhì)的能力。因此，本課題擬通過建立家兔的慢性房顫動物模型，進一步觀察房顫時心房電生理特性及結(jié)構(gòu)的變化，同時采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)從整體水平系統(tǒng)比較心房肌細胞及血清在

4、房顫時與正常竇性心律時蛋白質(zhì)表達的差異，建立兩者差異譜，篩選與房顫密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，為進一步闡明房顫的發(fā)生機制提供新線索。本課題擬分三部分進行，第一部分為：慢性房顫動物模型的建立及心房重構(gòu)的初步觀察；第二部分為：慢性房顫心房肌細胞及血清的蛋白質(zhì)組學(xué)研究；第三部分為：慢性房顫差異表達蛋白質(zhì)的再驗證。 第一部分：慢性房顫動物模型的建立及心房重構(gòu)的初步觀察 目的：探討以高頻率起搏刺激心房建立家兔慢性心房顫動模型的方法并觀察心房

5、重構(gòu)現(xiàn)象。 方法：30只家兔隨機分為左心房組(10只)、右心房組(10只)及對照組(10只)，左心房組及右心房組均予開胸植入高頻率起搏器(1000次/分)并起搏刺激30天，左心房組電極置于左心房心外膜，右心房組電極置于右心房心外膜，對照組亦植入起搏器但不起搏。術(shù)后定期監(jiān)測起搏、心房顫動的發(fā)生情況、房顫時心室率變化，測定起搏前及房顫發(fā)生后心房有效不應(yīng)期(AERP)的變化，術(shù)后30天，對照組及左心房組發(fā)生房顫(大于3周)的家兔取左心

6、房組織作電鏡檢查，觀察心房超微結(jié)構(gòu)變化情況。 結(jié)果：左心房組術(shù)后第7天，7只(70％)兔發(fā)生了房顫，2周時共有8只(80％)發(fā)生了房顫并能穩(wěn)定維持(與右心房組比較，P＜0.05)，30天時仍示房顫，其余2只兔至30天時仍呈起搏心律，而右心房組則僅有3只發(fā)生了房顫，對照組則未發(fā)生任何心律失常情況。心房顫動時的心室率最初明顯增快(P＜0.05)，隨后有所降低(P＜0.05)，但仍高于基礎(chǔ)心室率(P＜0.05)。家兔左心房AERP短于

7、右心房，房顫后左心房AERP縮短，AERP頻率適應(yīng)不良，與基礎(chǔ)狀態(tài)相比有顯著性意義。電鏡結(jié)果顯示，左心房組發(fā)生房顫(大于3周)后心房肌細胞線粒體腫脹，其它細胞結(jié)構(gòu)大致正常。 結(jié)論：長期高頻率起搏刺激家兔左心房是建立慢性房顫模型的有效方法，房顫后出現(xiàn)心房重構(gòu)現(xiàn)象。 第二部分：慢性房顫心房肌細胞及血清的蛋白質(zhì)組學(xué)研究 目的：研究慢性房顫家兔心房肌細胞及血清蛋白質(zhì)表達的變化，尋找出差異表達的蛋白質(zhì)并分析其與房顫的相互關(guān)

8、系。 方法：采用長期高頻率起搏刺激家兔左心房心外膜的方法制作慢性房顫模型，術(shù)后30天，取房顫時間大于3周的家兔(6只)作為實驗組，同時取6只已植入起搏器但未起搏的家兔作為對照組，比較這兩組心房肌細胞及血清蛋白表達的差異；取左心房游離壁(包括左心耳)組織進行酶解分離心房肌細胞，利用超聲波破碎細胞提取蛋白，血清標本則采用心臟直接穿刺采血法收集；雙向電泳技術(shù)分離蛋白質(zhì)，進行凝膠圖像分析比較，確定差異蛋白點，然后利用質(zhì)譜(MALDI-T

9、OF-MS)及生物信息學(xué)技術(shù)對差異蛋白點進行鑒定；最后登陸NCBI的protein網(wǎng)站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Protein&itool=toolbar)，尋找相關(guān)蛋白質(zhì)的資料，分析其與心房顫動的可能關(guān)系。 結(jié)果：心房肌細胞中鑒定出4個表達上調(diào)的蛋白質(zhì)，即縫隙連接蛋白40、熱休克蛋白70、鈣調(diào)磷酸酶及肌球蛋白輕鏈2；血清中鑒定出1個下調(diào)表達的蛋白質(zhì)為轉(zhuǎn)鐵

10、蛋白，4個表達上調(diào)的蛋白質(zhì)分別為補體C3前體、激肽原1、內(nèi)皮素1和結(jié)合珠蛋白；功能分析顯示這些蛋白質(zhì)與房顫有著一定的關(guān)系。 結(jié)論：慢性房顫家兔心房肌細胞中有4個表達上調(diào)的蛋白質(zhì)分別為縫隙連接蛋白40、熱休克蛋白70、鈣調(diào)磷酸酶及肌球蛋白輕鏈2，血清中鑒定出1個下調(diào)表達的蛋白質(zhì)為轉(zhuǎn)鐵蛋白，4個表達上調(diào)的蛋白質(zhì)分別為補體C3前體、激肽原1、內(nèi)皮素1和結(jié)合珠蛋白，這些蛋白質(zhì)與房顫可能有著密切關(guān)系。 第三部分：慢性房顫差異表達蛋

11、白質(zhì)的再驗證 目的：對蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定出的部分差異表達蛋白質(zhì)進行再驗證，并進一步分析其與房顫的相互關(guān)系。 方法：采用長期高頻率起搏刺激家兔左心房心外膜的方法制作慢性房顫模型，術(shù)后30天，取房顫時間大于3周的家兔(6只)作為實驗組，同時取6只已植入起搏器但未起搏的家兔作為對照組；采用免疫印跡技術(shù)(Westernblot)檢測左心房肌細胞中的縫隙連接蛋白40(Cx40)的表達，同時采用免疫組化技術(shù)檢測縫隙連接蛋白40的表達

12、和分布。 結(jié)果：Westernblot及免疫組化技術(shù)檢測結(jié)果均顯示Cx40在實驗組的表達高于對照組(0.53±0.09vs0.27±0.05，P＜0.01)，且分布發(fā)生改變，在對照組中Cx40排列規(guī)整，呈線狀分布于心肌細胞之間端一端連接的閏盤處，而在實驗組中Cx40排列紊亂，異常分布于心房肌細胞的側(cè)邊、細胞漿中與細胞核周圍，僅少量呈線狀位于閏盤。 結(jié)論：慢性房顫可引起縫隙連接蛋白40表達量增加且分布發(fā)生改變，提示縫隙連接

13、蛋白40可能參與了房顫的發(fā)生和維持，與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析結(jié)果一致，證明蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是準確可靠的。 通過以上研究，我們認為長期高頻率起搏刺激家兔左心房是建立慢性房顫模型的有效方法，心房顫動可導(dǎo)致家兔發(fā)生心房重構(gòu)，提示心房重構(gòu)是房顫發(fā)生和維持的一個重要機制。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，我們鑒定出了4個上調(diào)表達的細胞蛋白質(zhì)和5個差異表達的血清蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可能均參與了房顫的發(fā)生和維持，提示房顫的發(fā)生可能是多種機制、多種蛋白質(zhì)、多環(huán)節(jié)共同