具有抗真菌活性的光親和標(biāo)記探針的設(shè)計(jì)、合成及其功能研究.pdf

1、近二十年來，深部真菌感染的發(fā)生率及死亡率呈快速增長趨勢，而目前臨床上常用的抗真菌藥物存在療效有限、毒副作用大、抗菌譜窄和易產(chǎn)生耐藥性等問題，其中真菌的耐藥性成為深部侵襲性真菌感染治療失敗的主要原因。我們前期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)小檗堿、連翹酯苷A、芒果苷、黃芩素等天然小分子化合物都具有協(xié)同氟康唑抗耐藥真菌活性，與氟康唑聯(lián)合應(yīng)用，能顯著提高氟康唑的抗耐藥真菌活性，而且他們有相近的體內(nèi)外藥效，相似的藥效基團(tuán)，但由于作用機(jī)制不清，作用靶點(diǎn)不明，嚴(yán)重阻礙了以

2、此為基礎(chǔ)的新型抗真菌藥物研究。此外，兩藥協(xié)同抗耐藥真菌過程中，氮唑類抗真菌藥物的分布和外排有待進(jìn)一步的研究與確證。
　　光親和標(biāo)記(PAL)技術(shù)是用于確證、分離和表征新型生物分子及潛在藥物靶點(diǎn)的有效和可靠工具，特別用于未知靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。因此，我們采用PAL-CC-ABPP(Photoaffinitylabeling click chemistry activity-based protein profiling)技術(shù)將上述化合物做成

3、光親和探針，為后期運(yùn)用生物正交技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)、基因組學(xué)技術(shù)研究藥物靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。在前期針對小檗堿類探針分子進(jìn)行的靶點(diǎn)探測的研究基礎(chǔ)上，本課題基于光親和標(biāo)記技術(shù)對另一類協(xié)同抗真菌劑黃芩素及氮唑類抗真菌藥物進(jìn)行探針化設(shè)計(jì)合成，并對其應(yīng)用做了初步研究:
　　(1)設(shè)計(jì)合成三氟甲基苯基二氮雜環(huán)丙烯類光親和標(biāo)記基團(tuán)中間體TPD-6，TPD-6a，TPD-6b，TPD-10a，TPD-10b，TPD-10c，TPD-A，TSL-7，并通

4、過NMR、MS確認(rèn)其結(jié)構(gòu)。
　　(2)以具有協(xié)同氟康唑抗耐藥真菌活性的黃芩素為活性基團(tuán)、三氟甲基苯基二氮雜環(huán)丙烯為光親和標(biāo)記基團(tuán)、芐溴為反應(yīng)基團(tuán)、丙炔基團(tuán)為潛在的報(bào)告基團(tuán)，設(shè)計(jì)、合成了探針分子BE-1、BE-2、BE-4、BE-5、BE-6，并通過NMR、MS確認(rèn)其結(jié)構(gòu)?；钚詼y試結(jié)果表明，BE-2與氟康唑(1μg/ml)聯(lián)用，對耐藥白念珠菌(103)的MIC80為4μg/ml，兩藥合用的FICI值為0.039。BE-5與氟康唑(0

5、.25μg/ml)聯(lián)用的MIC80為8μg/ml，兩藥合用的FICI值為0.065，表明BE-2及BE-5都有較好的協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌活性，可作為活性探針用于后續(xù)研究。
　　(3)利用近幾年報(bào)道的帶有活性卡賓及香豆素前體的新型原位標(biāo)簽生成的探針技術(shù)，設(shè)計(jì)合成了BE-3，通過NMR、MS確認(rèn)其結(jié)構(gòu)，活性測試結(jié)果與BE-2相當(dāng)，其與氟康唑(1μg/ml)聯(lián)用對耐藥白念珠菌(103)的MIC80為4μg/ml，兩藥合用的FICI值

6、為0.039，證明其為活性探針。
　　(4)以三氟甲基苯基二氮雜環(huán)丙烯為光親和標(biāo)記基團(tuán)，以三氮唑類抗真菌活性類似物為母體，設(shè)計(jì)合成了氮唑類小分子探針FCZ-GB、FCZ-1、FCZ-2、FCZ-3、FCZ-4，并進(jìn)行了體外抗真菌活性測試，測得FCZ-GB、FCZ-3、FCZ-4對白念珠菌(Y0109)的MIC80值分別為:0.25μg/ml、4μg/ml、0.5μg/ml，可作為活性的氮唑類抗真菌藥物探針。
　　為了對設(shè)計(jì)合

7、成的探針分子的功能進(jìn)行初步的評估，我們首先將BE-2探針分子與白念珠菌的全蛋白提取液進(jìn)行蛋白結(jié)合的初步研究。SDS-PAGE結(jié)果顯示，蛋白出現(xiàn)特異性條帶，證實(shí)了BE-2具有蛋白結(jié)合功能和與熒光分子成像示蹤動能，具備用于后續(xù)靶點(diǎn)研究的可行性。將出現(xiàn)的特異性條帶作初步的質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示半胱氨酸或賴氨酸可能為BE-2結(jié)合在靶蛋白上的氨基酸殘基。以上實(shí)驗(yàn)為BE-3及BE-5的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。另外，F(xiàn)CZ-GB用以進(jìn)行結(jié)合靶蛋白的質(zhì)譜分析，對于F