基于活性的化學(xué)小分子探針的設(shè)計(jì)與合成及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、新藥研發(fā)是一個(gè)漫長而又耗時(shí)的過程,通常包括如下幾個(gè)階段:靶點(diǎn)的鑒別、先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)、小分子化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化、臨床前藥效學(xué)和毒性評(píng)價(jià)及臨床試驗(yàn)等。其中靶點(diǎn)鑒別是藥物發(fā)現(xiàn)過程的開始,也是最為關(guān)鍵的階段之一。利用化學(xué)小分子的多樣性,選擇適當(dāng)?shù)幕钚孕》肿?設(shè)計(jì)合成能夠高選擇性地作用于靶點(diǎn)蛋白,同時(shí)探測(cè)蛋白質(zhì)的功能、結(jié)構(gòu)以及與活性小分子作用模式的探針——化學(xué)小分子探針,可以為重大疾病的診斷和防治提供新的標(biāo)記物、新的藥物作用靶點(diǎn)和新的先導(dǎo)結(jié)構(gòu),從

2、而為創(chuàng)新藥物的發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。
　　 近年發(fā)展起來的基于活性的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,結(jié)合點(diǎn)擊化學(xué)技術(shù),是運(yùn)用設(shè)計(jì)合成末端帶有炔基或疊氮基且同時(shí)還具有活性的小分子探針共價(jià)標(biāo)記靶蛋白后,將改造后末端帶有炔基或疊氮基報(bào)告基團(tuán)(Reporter or Tag),如熒光素或生物素,通過點(diǎn)擊化學(xué)連接到探針分子上,這樣就可以成功標(biāo)記、檢測(cè)或用來純化其作用的靶點(diǎn)蛋白。
　　 格爾德霉素是目前開發(fā)較為成功的HSP90抑制劑,具有很強(qiáng)的抗原蟲和抗腫

3、瘤活性。格爾德霉素通過競爭性結(jié)合HSP90的N-末端ATP/ADP結(jié)構(gòu)域,特異性地抑制HSP90所必需的ATP酶活性,從而抑制了的分子伴侶功能,對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長、生存、凋亡產(chǎn)生重要影響。
　　 本課題在已知的格爾德霉素抗腫瘤作用構(gòu)效關(guān)系基礎(chǔ)上,在其分子結(jié)構(gòu)的17位引入末端炔基或疊氮基團(tuán),設(shè)計(jì)合成源自格爾德霉素,具有活性的探針(如可以選擇性、特異性與HSP90相結(jié)合)。與經(jīng)修飾、改造后帶末端炔基的報(bào)告基團(tuán)羅丹明B在點(diǎn)擊化學(xué)條件下,

4、與已經(jīng)和靶點(diǎn)蛋白共價(jià)結(jié)合的探針分子相鏈接,以標(biāo)記腫瘤細(xì)胞內(nèi)的靶點(diǎn)蛋白。
　　 本論文的具體內(nèi)容包括:
　　 1、格爾德霉素的發(fā)酵制備與分析鑒定在格爾德霉素的發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)了6種形態(tài)菌落(GF1,GF2,GF3,MF1,MF2,MF3),分別對(duì)其做了發(fā)酵條件摸索。發(fā)現(xiàn)使用固體平板培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí),用燕麥瓊脂比較適合菌株緩慢生長,有利于后來的液體發(fā)酵培養(yǎng)。防止初級(jí)代謝過于旺盛,次級(jí)代謝反而受到了抑制,菌體容易老化失去活性。液體發(fā)

5、酵培養(yǎng)超過6天,培養(yǎng)物變得十分粘稠,使得提取分離變得困難。因此用GF1作為種子接種在液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)6天后,立刻進(jìn)行提取分離為最佳發(fā)酵選擇。后經(jīng)提取純化,最終得到產(chǎn)率較高,純度大于95％的格爾德霉素。
　　 2、格爾德霉素化學(xué)小分子探針及報(bào)告基團(tuán)RB1的設(shè)計(jì)與合成共設(shè)計(jì)合成了格爾德霉素化學(xué)小分子探針3個(gè),通過與GA-FITC競爭結(jié)合HSP90α實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)G2與HSP90α具有較強(qiáng)的親和作用(EC50=13nM)。設(shè)計(jì)合成了報(bào)告基

6、團(tuán)RB1。靶點(diǎn)蛋白標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明,其非常適合用點(diǎn)擊化學(xué)。
　　 3、G2-RB1-HSP90α用作高通量篩選(HTS)模型的建立利用G2-RB1-HSP900α建立了適合用作高通量篩選的模型:從結(jié)果可知,DMSO(v/v)含量不超過4％為佳。最后優(yōu)化的條件為G2(2nM)與Hsp90α(30nM)親和反應(yīng)3小時(shí),加入RB1(5nM)和CuI(1 nM),DMSO(v/v)含量不超過4％為佳。通過該條件對(duì)已知的Hsp90抑制劑格爾德

7、霉素、TPR2A、ATP、ADP進(jìn)行了EC50測(cè)定。結(jié)果分別為104±3.1 nM,31±3.9nM,43.0±2.2,190±11.0。
　　 4、探針的抗腫瘤作用及與細(xì)胞靶點(diǎn)蛋白標(biāo)記實(shí)驗(yàn)研究采用MTT法對(duì)G2的抗腫瘤活性進(jìn)行評(píng)價(jià);通過對(duì)比發(fā)現(xiàn),設(shè)計(jì)合成的格爾德霉素G2化學(xué)小分子探針與格爾德霉素具有相似的抗腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用;在細(xì)胞蛋白標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中,均采用FTC-133腫瘤細(xì)胞株;第一組給以不同劑量的格爾德霉素化學(xué)小分子探針,