中藥抗真菌的活性篩選及作用機制研究.pdf

1、目的：對中藥抗侵襲性真菌作用進行統(tǒng)一大規(guī)模活性篩選，尋找有臨床應(yīng)用價值的抗侵襲性真菌感染的藥物。
　　方法：采用75％乙醇超聲提取中藥有效成分，CLSI推薦的微量液基稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC)考察對白念珠菌、新生隱球菌、煙曲霉常見侵襲性真菌的抑制作用，液體菌絲誘導(dǎo)實驗考察對白念珠菌菌絲抑制作用，并進一步考察強效抗侵襲性真菌中藥的抗菌譜及協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌作用，探尋其抗侵襲性真菌作用的共同或特異性的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制，同

2、時以免疫抑制小鼠胃腸道真菌感染模型考察中藥體內(nèi)抗侵襲性真菌感染的作用。
　　結(jié)果：本課題對《中藥大辭典》和《中華本草》共記載210味抗真菌中藥、《藥典》（2015版）618味中藥，122味維吾爾民族藥以及其他779味中藥，共1577味藥材，進行了抗白念珠菌、新生隱球菌、煙曲霉三種常見侵襲性真菌的系統(tǒng)性體外活性篩選，在2000μg/mL（生藥量）篩選濃度下，共發(fā)現(xiàn)抗真菌中藥453味，其中對新生隱球菌有抑制作用的有453味，對白念珠菌

3、有抑制作用的有149味，對煙曲霉有抑制作用的有25味，對三株侵襲性真菌均有抑制作用的有21味。在抑制菌絲形成方面，發(fā)現(xiàn)53味中藥在4mg/ml濃度下能完全抑制菌絲生長，其中重樓、粉萆薢、白薇、穿山龍、藜蘆、羌活在500μg/mL以下即能完全抑制菌絲形成;算盤子、蚊母樹、沒食子、青果、野薔薇、西青果、黃訶子皮、毛訶子、白薇、紅景天、煅龍齒、阿拉伯膠樹汁、鞣樹果、巖白菜、芒果核、一口鐘均為首次報道有抗真菌活性、且對白念珠菌MIC≤250μg

4、/ml的中藥，值得關(guān)注研究。
　　化學(xué)成分聚類分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗侵襲性真菌作用較好的中藥活性成分往往集中在鞣質(zhì)、皂苷、生物堿、揮發(fā)油四類。鞣質(zhì)類中藥往往抗真菌作用較強，通過“傳統(tǒng)分離、藥效追蹤”及直接分離可能的活性成分，發(fā)現(xiàn)抗真菌活性最高的活性部位大多在乙酸乙酯和正丁醇部位，且直接分離的鞣質(zhì)部位抗真菌活性也很強，初步斷定共同抗真菌活性部位為鞣質(zhì)。皂苷類以白薇為代表，并未分離出極性大的鞣質(zhì)，其活性部位集中在石油醚和二氯甲烷極性較小部位

5、。
　　作用機制研究方面，以鞣質(zhì)類單體化合物老鸛草素16μg/ml、沒食子酸64μg/ml、單寧酸4μg/ml以及中藥提取物白薇二氯甲烷4μg/ml為代表，研究了其對真菌超微結(jié)構(gòu)、細胞凋亡、活性氧含量的影響，發(fā)現(xiàn)藥物處理組超微結(jié)構(gòu)均有不同程度破壞，皂苷類白薇二氯甲烷組對細胞壁損傷尤為明顯，可能通過破壞細胞壁殺菌;鞣質(zhì)類化合物老鸛草素64μg/ml細胞中的活性氧是空白組的1.79倍，凋亡率為27.4％，可能通過升高活性氧促進白念珠菌

6、細胞凋亡。
　　體內(nèi)動物研究方面，以免疫抑制小鼠胃腸道白念珠菌感染為主要模型，以《藥典》用量為參考，一部分從直接抗真菌作用入手，考察體外抗真菌作用較強中藥的體內(nèi)抗真菌活性;另一部分從增強機體免疫入手，考察補益類中藥對胃腸道真菌感染小鼠的體內(nèi)抗真菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗真菌活性較強的五倍子(0.1g/kg、0.33g/kg和1.09g/kg)，黃連0.58g/kg，黃柏1.25g/kg以及補益類中藥黃芪2.25g/kg及5g/kg劑量，能

7、顯著提高小鼠生存率及存活時間，體外抗真菌能力較強的白薇、沒食子、拳參、赤芍、紅景天、蚊母樹、藜蘆、血三七，以及補益類中藥人參、山藥、熟地黃、五味子、黨參、白術(shù)在藥典相應(yīng)劑量下小鼠死亡率和生存時間與空白組并無差異。中藥單體方面，天然鞣質(zhì)類單體(沒食子酸10mg/kg、5mg/kg，老鸛草素1mg/kg、單寧酸1mg/kg)能顯著延長小鼠生存時間。
　　結(jié)論：本課題首次對《中華本草》和《中藥大辭典》中收錄的抗真菌中藥以及《藥典》記載的