兩類天然產(chǎn)物的抗真菌活性及作用機(jī)制研究.pdf

1、隨著廣譜抗生素的大量使用以及器官移植、放化療、血液透析等治療方法的廣泛應(yīng)用，臨床免疫缺陷患者的數(shù)量急劇增加，使得真菌感染的發(fā)病率和死亡率逐漸上升，真菌感染已成為臨床重要的感染病癥之一。目前用于治療真菌感染的抗真菌藥物主要有唑類、多烯類、棘白霉素類等，然而，隨著抗真菌藥物長(zhǎng)時(shí)間高劑量的使用，真菌耐藥性迅速出現(xiàn)并逐漸蔓延。耐藥性的出現(xiàn)增加了真菌感染的治療難度和治療費(fèi)用，同時(shí)，抗真菌藥物本身的毒副作用也限制了其在臨床上的長(zhǎng)期使用，因此亟需尋找

2、并開發(fā)新型的抗真菌藥物和有效的治療策略來(lái)克服真菌感染。
　　天然產(chǎn)物，尤其是來(lái)源于藥用植物的天然產(chǎn)物，是新藥開發(fā)的重要資源。地衣，是真菌和藻類高度結(jié)合的共生復(fù)合體，有食用和藥用價(jià)值。龍葵是茄科茄屬的草本植物，具有清熱，解毒，活血，消腫的功效。研究發(fā)現(xiàn)地衣和龍葵中均含有大量結(jié)構(gòu)新穎、生物活性多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物。本課題組從地衣Lobaria quercizan的內(nèi)生真菌Aspergillus versicolor中提取分離得到了一系列

3、苯醚類化合物;從龍葵全株中提取分離得到了一系列甾體生物堿類化合物。通過(guò)活性篩選發(fā)現(xiàn)了多個(gè)具有抗真菌活性的天然產(chǎn)物，包括6個(gè)二苯醚類化合物和3個(gè)甾體生物堿糖苷類化合物，其中，二苯醚類化合物diorcinol D(DD)和甾體生物堿糖苷類化合物solasodine-3-O-β-D-glucopyranoside(SG)的抗真菌活性較好且提取量較多。另外，由于白色念珠菌為臨床最常分離得到的致病真菌，因此，本論文以白色念珠菌為主要研究對(duì)象，以化

4、合物DD和SG為代表，研究了二苯醚類和甾體生物堿糖苷類天然產(chǎn)物的的抗真菌活性及其分子作用機(jī)理。
　　采用流式細(xì)胞儀，胞內(nèi)甘油含量測(cè)定，透射電子顯微鏡觀察以及實(shí)時(shí)定量PCR等多種實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)DD能夠損傷白色念珠菌的細(xì)胞膜，引起白色念珠菌的高滲透壓力;通過(guò)DCFH-DA染色，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)和激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)DD能夠引起胞內(nèi)活性氧(ROS)的積累;通過(guò)羅丹明123染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)DD能夠?qū)е戮€粒體膜電勢(shì)的增

5、強(qiáng);通過(guò)對(duì)線粒體外膜蛋白Tom70觀察，發(fā)現(xiàn)DD能夠?qū)е耇om70分布異常，線粒體功能紊亂。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，還原劑硫脲和線粒體功能抑制劑NaN3均能夠部分逆轉(zhuǎn)由DD引起的ROS積累、線粒體膜電勢(shì)改變、線粒體功能損傷，并且能夠部分抑制DD的殺真菌活性?；谝陨辖Y(jié)果可推斷DD的抗真菌機(jī)制為:DD損傷白色念珠菌細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞受到高滲透壓力脅迫，激活胞內(nèi)的HOG通路，增加甘油合成量，緩解滲透壓力;進(jìn)入胞內(nèi)的DD刺激線粒體產(chǎn)生大量ROS并超過(guò)細(xì)胞

6、正常代謝范圍，過(guò)量的ROS進(jìn)一步損傷線粒體功能，導(dǎo)致線粒體膜電勢(shì)增加，加速細(xì)胞死亡。
　　聯(lián)合用藥是治療真菌感染的有效治療策略。本研究采用棋盤式微量稀釋法檢測(cè)了化合物DD與氟康唑聯(lián)合用藥的抗真菌活性，并通過(guò)FICI模型，ΔE模型，以及時(shí)間-殺菌曲線法對(duì)兩藥的聯(lián)合效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)DD與氟康唑聯(lián)合用藥時(shí)，除兩株臨床氟康唑敏感菌株11E和11F外，其余8株野生菌株和臨床菌株均表現(xiàn)出協(xié)同抗真菌的效果，并且DD能夠顯著逆轉(zhuǎn)臨

7、床氟康唑耐藥菌株的耐藥性。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)DD能夠顯著抑制白色念珠菌對(duì)羅丹明123的外排能力，并且能夠顯著降低外排泵基因CDR1的表達(dá)量。通過(guò)麥角甾醇含量測(cè)定以及實(shí)時(shí)定量PCR等實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)DD能夠通過(guò)抑制氟康唑靶基因ERG11的表達(dá)，降低白色念珠菌中麥角甾醇含量。基于以上結(jié)果可推斷DD通過(guò)以下兩種途徑逆轉(zhuǎn)氟康唑耐藥性:(1)通過(guò)抑制外排泵的功能，增加胞內(nèi)氟康唑含量，逆轉(zhuǎn)其耐藥性;(2)與氟康唑協(xié)同作用于其靶基因ERG11,抑制麥角甾

8、醇生物合成，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)其耐藥性。
　　白色念珠菌是一種條件性致病真菌，其生長(zhǎng)具有二相性。當(dāng)外界環(huán)境改變或宿主免疫系統(tǒng)受損時(shí)，白色念珠菌會(huì)由酵母態(tài)轉(zhuǎn)向菌絲態(tài)轉(zhuǎn)變。菌絲態(tài)因其具有較強(qiáng)的黏附和侵襲能力，為白色念珠菌重要的毒力因子。通過(guò)XTT檢測(cè)、顯微觀察，發(fā)現(xiàn)SG能夠顯著抑制白色念珠菌的黏附、菌絲形成以及被膜形成的能力，并且其對(duì)成熟被膜也有較好的清除作用。在秀麗隱桿線蟲-白色念珠菌感染模型中，SG能夠通過(guò)抑制白色念珠菌菌絲的形成減弱其致病

9、性，提高感染線蟲的存活率，降低白色念珠菌毒力。Ras1-cAMP-Efg1信號(hào)通路是調(diào)控白色念珠菌菌絲形成的重要通路，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SG能夠下調(diào)此通路中基因的轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)SG也能夠抑制黏附因子Als3,Hwp1,Eap1的表達(dá)。cAMP在菌絲形成過(guò)程中起關(guān)鍵作用，外源補(bǔ)加cAMP能夠部分逆轉(zhuǎn)SG對(duì)菌絲形成和被膜形成的抑制效果。因此，推測(cè)SG降低白色念珠菌毒力機(jī)制如下:SG通過(guò)降低黏附因子的表達(dá)抑制白色念珠菌的黏附能力;通

10、過(guò)下調(diào)Ras1-cAMP-Efg1通路的轉(zhuǎn)錄水平，降低胞內(nèi)cAMP含量，抑制其由酵母態(tài)到菌絲態(tài)的形態(tài)轉(zhuǎn)變;通過(guò)對(duì)黏附和菌絲形成過(guò)程的抑制來(lái)降低其被膜形成的能力，進(jìn)而減弱白色念珠菌的毒力。
　　我們進(jìn)一步對(duì)SG的抗真菌機(jī)制進(jìn)行了深入研究。通過(guò)對(duì)提取分離和化學(xué)修飾得到的10個(gè)與SG結(jié)構(gòu)類似的甾體生物堿類小分子的構(gòu)效關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)SG結(jié)構(gòu)中的NH和葡萄糖基團(tuán)對(duì)其發(fā)揮抗真菌活性起到關(guān)鍵作用。通過(guò)HPLC-MS/MS檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同單糖取代的

11、SG結(jié)構(gòu)類似物中，只有葡萄糖基團(tuán)取代的SG能夠在胞內(nèi)和胞外粗酶反應(yīng)中水解產(chǎn)生大量的苷元solasodine。同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)solasodine雖對(duì)野生型白色念珠菌無(wú)抗真菌活性，但其對(duì)某些外排泵敲除菌株有較強(qiáng)的抗真菌活性。并且激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)SG和solasodine均能夠?qū)е掳咨钪榫麅?nèi)vacuole堿化，滲透性增加，內(nèi)容物滲漏，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡?；谝陨辖Y(jié)果推斷:化合物SG中的NH和葡萄糖基團(tuán)是其發(fā)揮抗真菌活性的關(guān)鍵活性基團(tuán);SG能

12、夠在白色念珠菌細(xì)胞內(nèi)水解形成大量苷元solasodine，而solasodine能夠進(jìn)一步損傷胞內(nèi)的vacuole結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
　　組蛋白結(jié)構(gòu)修飾能夠影響真核細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而影響后續(xù)的生理代謝過(guò)程。研究表明，組蛋白修飾是近期發(fā)現(xiàn)的新型抗真菌藥物靶點(diǎn)，并且與藥物耐藥性相關(guān)。我們?cè)谀钪榫蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)（Candida Genome Database）中找到四個(gè)與釀酒酵母組蛋白去甲基化酶JmjC結(jié)構(gòu)域基因同源且被

13、注釋為白色念珠菌組蛋白去甲基化酶的基因。利用基因同源重組原理，對(duì)白色念珠菌中的這四個(gè)組蛋白去甲基化酶基因分別進(jìn)行基因敲除，以進(jìn)一步探究白色念珠菌中組蛋白去甲基化酶與其耐藥性的相關(guān)性。通過(guò)微量稀釋法和平板稀釋法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)白色念珠菌去甲基化酶基因敲除后，其對(duì)唑類藥物的敏感性顯著提高。采用HPLC-MS/MS檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)基因敲除菌株中麥角甾醇含量明顯下降。因此推斷，白色念珠菌組蛋白去甲基化酶敲除菌株麥角甾醇生物合成量的減少是其對(duì)唑類藥物高敏感性

14、的原因之一。下一步實(shí)驗(yàn)將對(duì)唑類耐藥菌株中的組蛋白去甲基化酶進(jìn)行基因敲除，觀察其耐藥性變化，以進(jìn)一步探究組蛋白的去甲基化過(guò)程與唑類耐藥性之間的關(guān)系。
　　本論文以化合物DD和SG為代表，論述了二苯醚類和甾體生物堿糖苷類天然產(chǎn)物的抗真菌活性以及其分子作用機(jī)理，并首次對(duì)白色念珠菌組蛋白去甲基化酶與唑類藥物抗真菌活性的聯(lián)系進(jìn)行了報(bào)道。對(duì)二苯醚類和甾體生物堿糖苷類化合物的生物活性研究，為該類小分子作為抗真菌劑的開發(fā)提供了理論依據(jù)，對(duì)組蛋白去