基于氮唑類抗真菌藥物設(shè)計合成的熒光探針及其真菌細(xì)胞成像應(yīng)用.pdf

1、氮唑類抗真菌藥物作用靶點(diǎn)是羊毛甾醇14-α去甲基化酶（sterol14α-demethylase，又名CYP51）。準(zhǔn)確探究氮唑類藥物與CYP51酶的結(jié)合模式，有利于從靶酶角度設(shè)計合成活性更好的化合物。利用小分子熒光探針技術(shù)，與藥物偶聯(lián)，作為一種可視化工具，可對藥物在細(xì)胞內(nèi)的分布、與靶點(diǎn)結(jié)合或相互作用情況進(jìn)行示蹤。然而部分小分子熒光染料自身存在一些不足：1.脂溶性差，不易透過細(xì)胞膜，進(jìn)入真菌細(xì)胞;2.染料發(fā)射光譜位于紫外及可見光區(qū)，而生

2、物體及其組織在可見光的激發(fā)下自身會發(fā)射熒光，導(dǎo)致嚴(yán)重背景干擾，不適于細(xì)胞生物成像;3.染料始終帶有熒光，需要洗去以降低背景，應(yīng)用步驟繁瑣，成像信噪比低。本文的研究目的是設(shè)計合成基于氮唑類抗真菌藥物的小分子熒光探針用于真菌細(xì)胞CYP51酶成像并利用探針工具初步建立一種體外篩選化合物抗真菌活性的新方法。
　　新型的硅基羅丹明染料，在保留傳統(tǒng)羅丹明染料成像優(yōu)點(diǎn)的同時，通過硅原子取代橋連氧原子，使自身發(fā)射波長紅移至近紅外光區(qū)(600～90

3、0nm)從而適用于生物成像。我們在其基礎(chǔ)上引入內(nèi)酯螺環(huán)，合成出一種具有熒光“關(guān)-開”機(jī)制的新型探針。即未與靶點(diǎn)識別時探針自聚，內(nèi)酯螺環(huán)封閉于自聚體內(nèi)部，同時閉環(huán)，熒光淬滅;與靶點(diǎn)結(jié)合后自聚體解聚，同時通過內(nèi)酯螺環(huán)開環(huán)產(chǎn)生熒光。我們選取氟康唑作為偶聯(lián)藥物，在其側(cè)鏈引入長鏈連接子，通過縮合反應(yīng)與兩個不同結(jié)構(gòu)的硅基羅丹明染料底物偶聯(lián)，合成得到探針SiR-1，SiR-2。體外抗菌活性實(shí)驗(yàn)和計算機(jī)模擬結(jié)果顯示兩者均能進(jìn)入CYP51活性口袋，與靶酶

4、結(jié)合，發(fā)揮抑菌作用。光譜性質(zhì)證實(shí)兩個探針能產(chǎn)生自聚效應(yīng)調(diào)控?zé)晒獾漠a(chǎn)生與淬滅。
　　以體外實(shí)驗(yàn)作為基礎(chǔ)，進(jìn)一步，我們利用探針對真菌細(xì)胞成像。激光共聚焦實(shí)驗(yàn)表明，探針能順利的進(jìn)入真菌細(xì)胞中，并能夠在“No-wash”的情況下對CYP51進(jìn)行特異性成像。隨后我們設(shè)計了一系列加藥競爭性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不同濃度的氟康唑在真菌細(xì)胞內(nèi)使探針熒光不同程度降低，而加入陰性對照藥（作用于其他靶點(diǎn)的抗真菌藥物）兩性霉素B和89b均不能使熒光明顯降低。接著我們

5、利用探針對耐藥白念珠菌和敏感白念珠菌進(jìn)行成像，發(fā)現(xiàn)在耐藥菌中加入氟康唑后探針熒光降低不明顯，推測這可能由于耐藥菌阻止或外排氟康唑所致。最后我們采用熒光酶標(biāo)儀定性測定不同濃度氟康唑及伊曲康唑?qū)φ婢?xì)胞中探針熒光降低的影響。以熒光降低率衡量藥物活性，從藥物與靶酶結(jié)合的角度，初步建立了一種體外篩選化合物抗真菌活性的新方法。
　　綜上，本課題設(shè)計合成出了兩個新型氟康唑小分子熒光探針并將其應(yīng)用到了鮮為研究的真菌細(xì)胞中，對CYP51進(jìn)行特異性