蠶絲-膠原支架聯(lián)合轉染TGF-β3基因的BMSCs用于兔ACL重建的研究.pdf

1、背景：
　　前交叉韌帶(anterior cruciate ligament，ACL)是維持膝關節(jié)穩(wěn)定的重要結構，ACL損傷是運動醫(yī)學科常見的膝關節(jié)損傷性疾病，如不及時治療，容易引起膝關節(jié)的半月板、韌帶、關節(jié)軟骨等的繼發(fā)性損傷，膝關節(jié)不穩(wěn)定導致軟骨磨損加快，甚至導致骨性關節(jié)炎的發(fā)生。目前，對于ACL撕裂的治療主要是通過重建手術恢復膝關節(jié)的穩(wěn)定，而用于ACL重建的移植物主要有自體肌腱、同種異體肌腱和人工合成移植材料，但這些材料都存在

2、一定的缺陷。比如自體肌腱移植會加重患者損傷、手術時間延長，術后造成取材肌腱的功能喪失、康復時間延長等;異體肌腱移植主要面臨著宿主抗移植物免疫反應、可能會使受體有感染傳染性疾病的風險，另外其來源困難也是一個需要考慮的問題;人工合成移植材料短期內療效較好，但遠期效果仍面臨著韌帶松弛、力學強度下降、宿主免疫反應引起滑膜炎等問題。理想的ACL替代材料應該既能在關節(jié)腔內進行韌帶再生，同時植入骨隧道的兩端又能與骨形成良好的腱-骨界面。近年來隨著組織

3、工程的不斷發(fā)展，為制作理想ACL替代材料創(chuàng)造了可能。膠原是肌腱組織的重要組分，因其良好的生物相容性、能為于細胞提供良好的支持而最先被研究，但提取膠原的力學性能太差，難以提供有效的力學支持;脫膠蠶絲具有良好的力學性能和生物相容性，但其光滑的表面難以為細胞粘附提供條件。將蠶絲和膠原兩種生物材料進行交聯(lián)，既能獲得足夠的力學強度，又能為干細胞粘附提供支持。骨髓間充質干細胞(bonemarrow mesenchymal stem cells，BM

4、SCs)因取材方便、體外擴增快、具有多向誘導分化能力而被廣泛應用于組織工程中，是理想的種子細胞。轉化生長因子-β3(transforming growth factor-β3，TGF-β3)是一種具有多種調節(jié)功能的生長因子，既能調控軟骨和骨的再生過程，又能調控細胞外基質的分泌、減少組織再生過程中的瘢痕形成，因此是一種理想的調控組織工程ACL的細胞生長因子。局部單純應用生長因子往往會因其在體內的半衰期短而需要多次反復應用或單次大劑量應用才

5、能達到有效濃度，而將生長因子基因轉入到種子細胞，使生長因子在作用部位持續(xù)表達則解決了這一問題。基于以上研究進展，本課題主要從幾個方面進行了研究:(1)兔BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定;TGFβ3-Lentivirus慢病毒的構建;過表達TGF-β3的BMSCs細胞系的構建及鑒定;(2)蠶絲-膠原支架的制備及其生物學性能檢測;(3)蠶絲-膠原支架聯(lián)合轉染TGF-β3基因的BMSCs用于兔ACL重建的實驗研究;(4)對蠶絲-膠原支架進行改進，

6、將羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)負載于蠶絲-膠原支架兩端，用于兔ACL重建的實驗研究。
　　第一部分 兔BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定;TGFβ3-Lentivirus慢病毒的構建;過表達TGF-β3的BMSCs細胞系的構建及鑒定
　　目的：分離、培養(yǎng)兔BMSCs，通過流式細胞學技術和三系分化能力鑒定其干細胞特性;構建攜帶TGF-β3基因的慢病毒載體，對BMSCs進行轉染，建立穩(wěn)定表達TGF-β3的BMSCs

7、細胞系。
　　方法：我們通過骨髓腔沖洗、貼壁細胞培養(yǎng)的方法獲取兔BMSCs，通過細胞形態(tài)、流式細胞學和三系誘導分化對分離培養(yǎng)的BMSCs進行鑒定。構建攜帶TGF-β3基因，通過感染293T細胞進行病毒顆粒收集，經過病毒滴度、最佳MOI測定后用TGFβ3-Lenivirus感染BMSCs，用RT-PCR和Western Blot技術檢測TGF-β3基因在BMSCs中的表達，構建穩(wěn)定表達TGF-β3的BMSCs細胞系。
　　結果

8、：流式細胞學和三系分化檢測，我們培養(yǎng)的骨髓腔沖洗液貼壁培養(yǎng)細胞為BMSCs;通過構建的質粒轉染293T細胞得到了病毒滴度為4.85×108TU/ml的病毒液，而病毒在MOI為200時對兔BMSCs的轉染效率可達100％;通過RT-PCR和Western Blot技術檢測發(fā)現(xiàn)TGF-β3在穩(wěn)轉的BMSCs細胞系中過表達。
　　結論：通過骨髓沖洗液貼壁培養(yǎng)獲取的兔BMSCs具有干細胞特征和多向分化能力;構建的TGFβ3基因慢病毒載體在

9、轉染BMSCs后能穩(wěn)定表達，建立了穩(wěn)轉細胞系。
　　第二部分 蠶絲-膠原支架的制備及其生物學性能檢測
　　目的：制備蠶絲-膠原文架并對其生物學性能進行分析。
　　方法：通過乙酸抽提的方法從豬跟腱中獲?、裥湍z原，用Na2CO3溶液水浴法對生蠶絲網片進行脫膠，將膠原溶液和脫膠蠶絲網片通過冷凍干燥和真空熱交聯(lián)法進行交聯(lián)，制作蠶絲-膠原支架材料。用Instron萬能拉力機對生蠶絲網片、脫膠蠶絲以及蠶絲-膠原支架進行生物力學測定

10、。將BMSCs與蠶絲-膠原支架進行共培養(yǎng)，用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察支架表面細胞的形態(tài)。
　　結果：蠶絲網片在脫膠前后及整合膠原后，其力學性能（最大拉力和剛度）無明顯變化;BMSCs與蠶絲-膠原支架進行共培養(yǎng)后仍保持著梭形，細胞狀態(tài)良好。
　　結論：脫膠、整合膠原等過程未對蠶絲力學性能造成影響，整合膠原后支架表面形成了多孔、粗糙的表面，更有利于細胞的粘附和生長。
　　第三部分 蠶絲-膠原支架聯(lián)合轉染TGF-β3基因

11、的BMSCs用于兔ACL重建的實驗研究
　　目的：將轉染TGF-β3基因的BMSCs種植于蠶絲-膠原支架上，觀察其用于兔ACL重建后關節(jié)腔內韌帶再生和兩端腱-骨愈合的情況。
　　方法：40只12周齡新西蘭大白兔，隨機平均分為4組進行雙側ACL重建:Auto組，以自體半腱肌肌腱重建ACL;S組，以單純蠶絲-膠原支架重建ACL;S+C組，以BMSCs(轉染GFP-Lentivirus，并穩(wěn)定表達GFP)種植于蠶絲-膠原支架后用于

12、ACL重建;S+C-T組，轉染TGF-β3基因的BMSCs種植于蠶絲-膠原支架后用于ACL重建。術后2周、4周對實驗動物的膝關節(jié)活動度(ROM)進行測量，術后2周對膝關節(jié)進行MRI掃描，觀察關節(jié)腔內術后情況;術后4周、16周兩個時間點分別隨機處死每組實驗動物的一半，每組標本中的5個進行組織學檢測，包括關節(jié)腔內韌帶的組織學檢測和骨隧道腱-骨愈合情況的組織學監(jiān)測;每組中余下5個標本進行micro-CT和生物力學檢測。
　　結果：術后第

13、2周，S組、S+C組、S+C-T組兔膝關節(jié)ROM明顯優(yōu)于Auto組;而第4周時，各組間ROM未見明顯差異。MRI顯示蠶絲-膠原支架在體內水分明顯較自體韌帶多。HE和免疫組織化學染色顯示S+C-T組在16周時有更好的細胞排列和細胞外基質沉積;Russell-Movat染色顯示S+C-T組在16周時腱-骨界面形成了典型的生理性腱-骨界面的四層結構，而S組和S+C組在腱-骨界面多形成伸入移植物的硬化骨小梁，而Auto組在腱-骨界面則觀察到了典

14、型的Sharpey's纖維。Micro-CT顯示感興趣區(qū)域(area of interesting，AOI)在4周和16周的骨形成指標(BV/TV，BMD)均顯著高于Auto組，這和生物力學結果相一致。
　　結論：轉染TGF-β3基因的BMSCs種植于蠶絲-膠原支架后用于兔ACL重建，不僅能獲得較好的關節(jié)腔內韌帶再生，同時能夠達到良好的腱-骨愈合效果。
　　第四部分 兩端負載羥基磷灰石的蠶絲-膠原支架用于兔ACL重建的實驗研

15、究
　　目的：用模擬體液結晶法將HA結合到蠶絲網片上，將兩端負載HA的蠶絲-膠原支架用于兔ACL重建的實驗研究，觀察其腱-骨界面的愈合情況。
　　方法：用模擬體液結晶法將HA結合到蠶絲網片上，然后將網片和膠原溶液通過冷凍干燥和真空熱交聯(lián)法進行交聯(lián)，制作兩端負載HA的蠶絲-膠原支架材料。24只新西蘭大白兔，隨機平均分為2組進行左側下肢ACL重建:S組，單純蠶絲-膠原支架用于ACL重建;HA組，兩端負載HA的蠶絲-膠原支架用于A

16、CL重建。術后16周處死實驗動物，收集標本，對ACL的遠期效果進行評價:每組中6個標本進行HE和蕃紅-O和免疫組織化學染色對腱-骨愈合進行評價;剩余6個標本進行micro-CT、生物力學以檢測以及骨性關節(jié)程度的評分。
　　結果：術后第16周，組織學染色顯示S組和HA組腱-骨界面可見骨小梁長入移植物內，而在HA組骨小梁長入更為明顯，micro-CT矢狀面上顯示骨隧道內部有條狀骨形成;免疫組化顯示HA組在腱-骨界面有更多的collag

17、enⅠ和osteocalcin的表達，而S組有更多collagenⅢ的表達，說明HA組腱-骨界面骨形成更早、更成熟。HA組Micro-CT顯示感興趣區(qū)域的骨形成指標(BV/TV，BMD)均顯著高于S組，與生物力學結果相一致。對膝關節(jié)骨性關節(jié)炎評價結果顯示HA組Mankin評分明顯小于S組，進一步說明HA組ACL重建后膝關節(jié)較S組重建后更為穩(wěn)定。
　　結論：兩端負載HA的蠶絲-膠原支架用于ACL重建后雖未在腱-骨界面觀察到典型的生理