調控番紅花糖苷合成、柱頭發(fā)育基因挖掘及功能研究.pdf

1、番紅花是鳶尾科番紅花屬球莖類草本植物，具有良好的活血化瘀、涼血解毒、解郁安神的功效，現(xiàn)代多用于治療心腦血管疾病和抑郁癥。其特有的以藏紅花苦素、藏花醛、西紅花酸及其糖苷衍生物西紅花總苷為代表的類胡蘿卜素類化合物是發(fā)揮藥效的主要成分。番紅花柱頭是西紅花苷等成分合成和積累的場所，柱頭作為藥用部位其生物量較小而導致產量稀少。整合分析多重組學數(shù)據，發(fā)掘西紅花柱頭發(fā)育或糖苷合成相關基因，利用分子生物學手段，開展番紅花有效成分生源途徑解析，并驗證影響

2、柱頭發(fā)育基因的生物學功能。在此基礎上，培育高產優(yōu)質番紅花品系，能有效緩解西紅花市場的供需矛盾。
　　為了發(fā)現(xiàn)潛在的關鍵酶基因及分子調控基礎，本課題針對不同發(fā)育時期的番紅花柱頭同步進行了轉錄組和代謝組分析，特別監(jiān)控與西紅花苷合成途徑相關的代謝流。從轉錄組中共組裝得到269，943條Unigenes，根據差異基因的表達趨勢可將所有的差異基因分為7種表達模式，共注釋出181條可能參與西紅花苷合成的酶基因，篩選出63個可能調控西紅花苷合成

3、的轉錄因子。而代謝組分析指認出15個西紅花苷合成途徑中的化合物，其含量變化趨勢可分為4種模式。為了深入挖掘基因和化合物間的相關性，本研究整合兩個組學數(shù)據，構建了“轉錄因子-基因-化合物”共表達網絡，切實將候選基因的范圍縮小到32條酶基因及28條編碼轉錄因子的轉錄本。更重要的是，共表達網絡篩分別篩選到7、4和4條目前在西紅花苷合成途徑中未被具體研究的關鍵酶基因β-GS、ADH和UGT。釀酒酵母的代謝工程研究顯示篩選的CsADH酶可催化合成

4、西紅花酸，亦證實共表達網絡篩選目標基因方法的可靠性。
　　綜合“基因-化合物”共表達網絡分析及熒光定量PCR結果，指認AGL6b基因的表達與西紅花酸隨柱頭發(fā)育的含量變化正相關。而AGL6基因屬于MADS-box調控因子家族，該家族在多種模式植物中都表現(xiàn)出調控花發(fā)育的功能，由此推測:番紅花AGL6b基因與西紅花苷合成途徑中的次生代謝產物積累有密切聯(lián)系，可能是通過調控番紅花花器官的發(fā)育，引起柱頭生物量的改變而導致次生代謝物含量變化。因

5、而對來自西紅花轉錄組數(shù)據庫中的17條MADS-box轉錄因子進行了系統(tǒng)的生物信息學分析，解讀核苷酸序列，及對其編碼的氨基酸序列的組成成分、理化性質、信號肽、導肽、跨膜結構域、亞細胞定位、親疏水性、蛋白質的二級、三級結構及功能域進行預測分析，并將番紅花和其他植物的MADS-box蛋白進行同源比對，同時構建了番紅花和模式植物擬南芥MADS-box蛋白家族的系統(tǒng)進化樹，其結果為今后進一步深入研究番紅花MADS-box蛋白的生物學功能提供可靠的

6、參考依據。
　　整合共表達網絡及番紅花轉錄組，獲得5條在番紅花柱頭中特異性高表達的MADS-box基因，命名為SCR(Stigma and Crocins Regulator)。為了驗證此類基因對于番紅花柱頭發(fā)育或糖苷合成的調控作用，對所得序列進行克隆和分析，初步開展亞細胞定位及擬南芥過表達的實驗。CsSCR基因編碼的氨基酸分子量在25.0kDa左右，等電點在9.15左右，均為堿性蛋白。同時結構域分析發(fā)現(xiàn)5個蛋白都含有60個氨基酸

7、組成的MADS結構域，以及其后都接有93個氨基酸大小的K-BOX結構域，證明5條蛋白都屬于MADS轉錄因子家族。亞細胞定位實驗結果證實5條番紅花SCR蛋白的轉錄因子特性，其定位于細胞核中發(fā)揮轉錄調控作用;而擬南芥過表達實驗發(fā)現(xiàn)，CsSCR3和CsSCR5可調控擬南芥花發(fā)育，導致早花現(xiàn)象出現(xiàn)。
　　綜上所述，本研究整合多重組學數(shù)據，報道了多個參與西紅花苷合成途徑的候選基因，為后續(xù)開展番紅花有效成分生源途徑解析奠定了基礎，并提供了一個