LaeA和LaeA-like蛋白調(diào)控草酸青霉無(wú)性發(fā)育及糖苷水解酶合成的研究.pdf

1、青霉屬真菌能夠產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)于人類疾病治療和農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要影響。同時(shí)，很多青霉能夠產(chǎn)生木質(zhì)纖維素降解酶，并被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)，有力的推動(dòng)了生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。其中，革酸青霉（Penicillium oxalicum）能夠產(chǎn)生酶系完全的木質(zhì)纖維素降解酶，其高產(chǎn)突變菌株已經(jīng)應(yīng)用于纖維素酶工業(yè)生產(chǎn)多年。但是，高產(chǎn)突變株伴隨著產(chǎn)孢能力嚴(yán)重下降，由此帶來(lái)了工業(yè)生產(chǎn)成本的增加。此外，研究發(fā)現(xiàn)，草酸青霉中具有28個(gè)次級(jí)代謝基因簇，具有潛在的生

2、產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力。因此，深入了解纖維素酶合成及孢子形成的調(diào)控機(jī)制及糖苷水解酶合成機(jī)制，對(duì)草酸青霉的工業(yè)應(yīng)用具有重要意義。
　　我們主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.草酸青霉LaeA調(diào)控孢子發(fā)生及次級(jí)代謝LaeA對(duì)于草酸青霉孢子合成及次級(jí)代謝具有重要的調(diào)控作用。在草酸青霉中，laeA缺失后（ΔlaeA）嚴(yán)重影響分生孢子的合成，ΔlaeA中與孢子合成相關(guān)的brlA和abaA表達(dá)量顯著下調(diào)，表明LaeA的調(diào)控位于這兩個(gè)基因上游。當(dāng)在

3、ΔlaeA中過(guò)表達(dá)brlA能夠明顯上調(diào)brlA，abaA和wetA的表達(dá)量，但是仍不能恢復(fù)分生孢子的缺陷。ΔlaeAΔcreA完全阻斷孢子形成，7個(gè)與色素合成相關(guān)的基因（albA/wA，abrB/yA, arpA，aygA，arpA-like，arpB，arpB-like）和3個(gè)孢子壁蛋白基因（rodA，rodA-like和rodB）表達(dá)幾乎沉默，推測(cè)這是雙敲菌株產(chǎn)孢障礙的重要原因。同時(shí)，ΔlaeA，ΔcreA及ΔlaeAΔcreA中細(xì)

4、胞壁形成相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，使ΔlaeA和ΔlaeAΔcreA對(duì)于CR，SDS和CFW的耐受能力明顯下降。此外，草酸青霉中28個(gè)次級(jí)代謝基因簇中，有4個(gè)簇在ΔlaeA中表達(dá)沉默，其中2個(gè)與BrlA缺失株中沉默基因簇重合，表明LaeA參與基因簇沉默部分由BrlA介導(dǎo)。共調(diào)控基因簇中6個(gè)典型的連續(xù)區(qū)域位于染色體端粒區(qū)附近，表明LaeA調(diào)控的基因簇具有朝向端粒區(qū)的位置偏好性。沉默基因簇在ΔlaeAΔcreA菌株中脫阻抑，表明敲除laeA后，Cr

5、eA的缺失能夠修復(fù)基因簇的抑制作用，可能是由另一LaeA-like甲基轉(zhuǎn)移酶PDE03083介導(dǎo)。另外，草酸合成基因PDE_06062在三株突變株中都表達(dá)下調(diào)，革酸含量測(cè)低于野生型，ΔlaeAΔcreA更是表現(xiàn)出疊加效應(yīng)，革酸合成最低。酵母雙雜交顯示，盡管LaeA與CreA并沒(méi)有直接的相互作用，但是LaeA和CreA的共調(diào)控功能對(duì)于無(wú)性孢子的正常合成及基因簇的表達(dá)是必需的。在革酸青霉中，LaeA能夠與纖維素酶/半纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄激活因

6、子X(jué)lnR及染色質(zhì)重塑因子Swi6相互作用（未發(fā)表），推測(cè)LaeA被XlnR招募，通過(guò)組蛋白修飾及染色質(zhì)重塑的功能使得染色質(zhì)開(kāi)放，激活孢子形成、次級(jí)代謝基因簇相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。
　　2.草酸青霉LaeA-like蛋白對(duì)于纖維素酶基因表達(dá)及孢子發(fā)生調(diào)控初步研究LaeA對(duì)于木質(zhì)纖維素降解酶的合成具有調(diào)控作用。氨基酸序列分析顯示，以LaeA為代表的草酸青霉第23家族成員(LaeB、LaeC、LaeD、LaeE、LaeF、LaeG、LaeH

7、、LaeI)都含有SAM結(jié)合位點(diǎn)，預(yù)測(cè)為蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶。進(jìn)化樹(shù)分析表明第23家族甲基轉(zhuǎn)移酶與LaeA親緣關(guān)系較近，推測(cè)它們對(duì)于纖維素酶合成及孢子發(fā)生的調(diào)控或許與LaeA具有相似的調(diào)控模式。研究發(fā)現(xiàn)，ΔlaeB在單一碳源培養(yǎng)基上，菌體生長(zhǎng)較差，菌落褶皺多，孢子計(jì)數(shù)進(jìn)一步確認(rèn)ΔlaeB孢子數(shù)量較野生型略低。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，ΔlaeB菌絲數(shù)量較少，產(chǎn)孢延遲約2h。LaeB缺失菌株（ΔlaeB）纖維素酶合成顯著下調(diào)，相反，ΔlaeE、ΔlaeI濾