CBMs功能架構(gòu)分析及糖苷水解酶TrCel12A熱穩(wěn)定性機(jī)理研究.pdf

1、纖維素類生物質(zhì)的高效轉(zhuǎn)化利用是解決資源錯(cuò)置、環(huán)境污染與能源缺乏的重大課題，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。大部分天然纖維素降解酶都具有催化模塊(CDs)、碳水化合物結(jié)合模塊(CBMs)。CBMs具有識別和結(jié)合底物的功能，輔助CDs對底物的催化水解。設(shè)計(jì)獲得高效纖維素降解酶有兩大策略，第一提高纖維素酶蛋白對纖維素類底物的結(jié)合力，可以通過增加CBMs模塊的數(shù)量和提高CBMs和CDs對底物的結(jié)合力來實(shí)現(xiàn);其次，設(shè)計(jì)提高酶蛋白整體結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性。生物煉制產(chǎn)

2、業(yè)采用高溫生產(chǎn)環(huán)境，能夠加快反應(yīng)速度并減少雜菌污染，因此需要高熱穩(wěn)定性的酶蛋白提高降解效率并降低生產(chǎn)成本。
　　GH12家族的TrCel12A是只有一個(gè)CD模塊的嗜中溫內(nèi)切纖維素酶，只有234個(gè)氨基酸，結(jié)構(gòu)簡單，具有很大的改造空間。鑒于定向篩選的不確定性以及長時(shí)耗，本文綜合生物信息學(xué)分析手段與分子動(dòng)力學(xué)模擬研究策略，對不同結(jié)合模式的CBMs家族進(jìn)行了功能架構(gòu)分析，來篩選適合與TrCel12A重組的CBMs模塊;運(yùn)用分子動(dòng)力學(xué)模擬探

3、宄該酶的熱穩(wěn)定性機(jī)制，定位潛在的突變靶點(diǎn)，并設(shè)計(jì)了四個(gè)突變期望提高該糖菅水解酶的熱穩(wěn)定性。計(jì)算方法和實(shí)驗(yàn)方法的結(jié)合大大減少了實(shí)驗(yàn)測定的工作量。本文主要內(nèi)容及研究結(jié)果如下:
　　(1) CBMs能夠自主折疊并發(fā)揮功能，在CAZy數(shù)據(jù)庫中，序列相似度30％以上的CBMs被歸于同一CBMs家族，具有相似的結(jié)構(gòu)特征。對三種不同結(jié)合模式的7個(gè)CBMs家族進(jìn)行功能架構(gòu)分析，對研究CBMs的功能混雜性和理性設(shè)計(jì)提高CBMs結(jié)合力都具有重要理論價(jià)

4、值。本文研究發(fā)現(xiàn)，CBMs功能架構(gòu)處偏好芳香族氨基酸(W、Y)和極性氨基酸(Q、R、N)，結(jié)合模式不同的CBMs對酸堿氨基酸的偏好不同，這是CBMs識別底物的分子基礎(chǔ);不同家族在功能架構(gòu)處采用增加亞位點(diǎn)數(shù)量或增加亞位點(diǎn)上的氨基酸數(shù)量來保障對底物的結(jié)合能力;功能架構(gòu)序列譜表明不同CBMs家族具有不同數(shù)量的底物結(jié)合亞位點(diǎn)，而且與CDs相比，保守氨基酸數(shù)量相對較少，通常為芳香族氨基酸(W、Y)和弱極性氨基酸(N、Q)，大部分分布在A型CBMs

5、中;不同CBMs家族功能架構(gòu)上的絕對保守氨基酸、相對保守氨基酸和可變氨基酸識別碳水化合物底物糖環(huán)上各羥基氧原子的模式各不相同，從而不同CBMs家族可對結(jié)構(gòu)相近的碳水化合物底物進(jìn)行部分識別，這可能是不同CBMs家族產(chǎn)生功能混雜性的分子基礎(chǔ)。
　　(2)應(yīng)用分子動(dòng)力學(xué)模擬分析TrCel1A的熱穩(wěn)定性的影響因素。本文使用Gromacs軟件模擬溶劑環(huán)境，并設(shè)置了四個(gè)溫度梯度(300K、350K、400K、500K)對TrCel1A進(jìn)行分子

6、動(dòng)力學(xué)模擬。分析RMSF值發(fā)現(xiàn)蛋白的柔性分布是不均勻的，蛋白的N末端和活性中心是高柔性位點(diǎn);四個(gè)位于不同二級結(jié)構(gòu)上的N末端突變的分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果表明，引入大的疏水基團(tuán)(G41F)以及引入帶電基團(tuán)(Q6K)等方式能夠增強(qiáng)N末端內(nèi)部的相互作用，從而提高酶蛋白整體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性;S25P通過引入內(nèi)酰胺環(huán)的方式降低了α-螺旋的柔性，但是降低單個(gè)二級結(jié)構(gòu)的柔性沒有提高整體蛋白的熱穩(wěn)定性。
　　(3)N末端突變對TrCel1A熱穩(wěn)定性的影響的