糖苷水解酶性質(zhì)高通量分析平臺的建立及GH12家族酶組分多功能活性架構的機理研究.pdf

1、木質(zhì)纖維素的有效利用為解決未來社會能源危機問題提供了可能的途徑。多功能性的糖苷水解酶組分在生物資源轉(zhuǎn)化過程中具有重要的應用價值。本論文主要優(yōu)化了現(xiàn)有糖苷水解酶的高通量功能表征平臺;并通過對多功能性糖苷水解酶組分GH12家族纖維素酶的催化機理進行闡釋，一定程度上提高了對海量基因序列進行自動功能注釋的準確度，同時為進一步理解糖苷水解酶結(jié)構和功能關系及對其多功能活性架構指明了方向。
　　 本論文開展的相關研究工作及主要成果如下:

2、>　　 1.優(yōu)化了現(xiàn)有糖苷水解酶的活性電泳技術，結(jié)合數(shù)字圖像處理技術，為高通量快速表征糖苷水解酶的功能與性質(zhì)奠定了基礎。
　　 采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，將電泳后酶組分與底物的酶促動力學反應在凝膠中進行，建立了木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、纖維素內(nèi)切酶和纖維素外切酶的活性電泳展示技術。通過數(shù)字圖像處理技術對電泳條帶的灰度值進行定量提取，并與其蛋白質(zhì)濃度（或酶活性）的相關性進行分析，表明條帶灰度值與其蛋白質(zhì)濃度（或酶活性）具

3、有線性正相關性。結(jié)合非變性凝膠電泳技術和數(shù)字圖像處理技術，展示了不同酶組分的pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性;表明各酶組分在降解不溶性聚合物時具有明顯的協(xié)同關系。在此基礎上，通過對比非變性聚丙烯酰胺凝膠中對應蛋白條帶相對遷移率的變化，快速分析了不同糖苷水解酶與其底物的結(jié)合力。本文建立的糖苷水解酶性質(zhì)表征技術，不僅可以更方便地展示天然生境條件下各酶組分的多樣性和其固有反應特性，還可應用于糖苷水解酶工程改造后的快速篩選過程。因此，該技術的建立具有重要

4、的應用價值和實踐意義。
　　 2.闡明了糖苷水解酶GH12家族活性架構中的功能決定性氨基酸殘基，實現(xiàn)了其酶組分功能的理性轉(zhuǎn)變
　　 從系統(tǒng)生物學角度對糖苷水解酶GH12家族的進化歷史、序列、結(jié)構和功能進行了分析，構建了該家族的系統(tǒng)發(fā)育樹。在此基礎上通過對直接參與底物結(jié)合的活性架構區(qū)域進行序列和結(jié)構比對，快速定位了其功能決定性氨基酸殘基。以瑞氏木霉Trichoderma reesei QM9414和黑曲霉Aspergill

5、us niger CBS120.49的GH12家族纖維素酶EGⅢ和EglA為研究對象，對其活性架構進行了分析。分析表明，纖維素酶組分EGⅢ中的催化殘基E116和E200在整個GH12家族中絕對保守，其分別通過側(cè)鏈基團的羧基催化糖苷鍵的斷裂;N95位氨基酸殘基因能與酸堿催化基團E200形成氫鍵，對整個GH12家族酶分子的最適pH產(chǎn)生影響;W22位氨基酸殘基與-2位糖環(huán)間形成的C-H...π作用力在酶分子識別和結(jié)合不同底物分子過程中發(fā)揮重要

6、作用，是該酶分子多功能性的物質(zhì)與結(jié)構基礎。將EGⅢ的N95位氨基酸進行天冬氨酸(D)的突變，最適pH向酸性方向偏移了0.6個pH單位;突變體W22Y降解NPC等小分子的活力約分別為其野生型的338％(EGⅢ)和468％(EglA);同時發(fā)現(xiàn)其明顯提高了對纖維素類底物的結(jié)合力，具有了一定的持續(xù)性降解能力;熒光輔助糖電泳(FACE)檢測結(jié)果表明，突變體W22H對磷酸膨脹纖維素(PASC)降解后的產(chǎn)物中含有大量纖維四糖，為纖維素酶的有效誘導提

7、供了寡糖來源。另外，本研究還證實，纖維素酶活性的高低是底物結(jié)合與產(chǎn)物釋放的平衡過程。對結(jié)合特異性決定位點進行的理性突變，可實現(xiàn)其酶學功能的快速轉(zhuǎn)變;而對催化殘基周圍的關鍵氨基酸進行的突變，則可一定程度上改變其酶學性質(zhì)。這為通過蛋白質(zhì)工程改造更多具有優(yōu)良反應特性的糖苷水解酶類提供了理性指導。
　　 3.闡明了GH12家族酶組分多功能性的催化機理
　　 通過對GH12家族纖維素酶組分與不同底物結(jié)合形成的復合物進行結(jié)構分析研究

8、發(fā)現(xiàn)，纖維素酶功能多樣的結(jié)構基礎在于其功能決定性氨基酸殘基與不同底物配體共有結(jié)構間的部分識別。X光多晶粉末衍射(XRD)測定結(jié)果表明，GH12家族纖維素酶組分作用后的CF11結(jié)晶度降低，表明其能一定程度上破壞纖維素的有序結(jié)構。采用原子力顯微鏡(AFM)對纖維素酶作用后的CF11切面結(jié)構中的微纖絲直徑進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)其最外層微纖絲明顯比其內(nèi)部微纖絲直徑大。根據(jù)該家族酶分子結(jié)合特異性決定位點的特殊架構，一定程度上闡明了其在微纖絲上的特有結(jié)合模

9、式及其類似“Expansin”的活性。多功能性催化機理的闡釋為高效降解纖維素酶系的人工復配或重構指明了方向。
　　 總之，我們建立了一種以蛋白質(zhì)家族為對象、對其活性架構進行研究以快速定位其功能決定性氨基酸殘基的方法。對活性基團的架構研究，為闡明其催化機理、提高自動功能注釋的準確度及實現(xiàn)功能的快速轉(zhuǎn)變和理性指導酶分子的工程化改造指明了方向;同時，高通量蛋白質(zhì)功能表征平臺的建立對充分展示酶分子的多樣性及快速篩選優(yōu)良突變體都具有重要意