鐵負荷過低及visfatin對EMMPRIN表達的作用及機理探討.pdf

1、冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦侨祟惤】档闹匾{，現有的治療手段主要側重于早期控制引發(fā)冠心病的危險因素和晚期消除較大粥樣斑塊對血流動力學的影響。然而，如何延緩斑塊的進展，并使斑塊趨于穩(wěn)定依然是棘手的問題。
　　 在動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生發(fā)展中，炎癥因子對斑塊的穩(wěn)定性意義重大。參與影響斑塊穩(wěn)定的炎癥因子有很多，如MMPs、IL1-β、TNF-α、IL-6等。細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子（EMMPRIN）作為近年來發(fā)現的一

2、種炎癥因子，現被證實在影響斑塊穩(wěn)定性方面起了極其重要的作用。研究發(fā)現，EMMPRIN在AS病變不穩(wěn)定斑塊處高表達。AS斑塊處，EMMPRIN同MMPs共定位。細胞水平研究發(fā)現，EMMPRIN不僅能控制巨噬細胞、泡沫細胞MMPs的表達，還能調節(jié)MMPs的活性。因此，研究體內外各種因素對以EMMPRIN為中心的炎癥因子表達的影響，可以為臨床治療AS疾病提供新的思路和策略。
　　 鐵是人體重要的營養(yǎng)成分，同時鐵與心血管事件的發(fā)生關系密

3、切。曾有學說提出降鐵治療能減少心血管事件的發(fā)生率，但此學說迄今仍有爭議。目前對鐵與心血管事件的研究集中于鐵負荷過高所引起的自由基產生、氧化低密度脂蛋白生成、以及內皮功能受損。但對降鐵治療效果不好的原因尚未明確，有關鐵負荷過低和炎癥反應關系的研究很少。明確鐵負荷過低對以EMMPRIN為中心的炎癥因子表達的關系及其機理，可為臨床治療AS及解決關于降鐵治療的爭論提供新的實驗和理論依據。
　　 內臟脂肪素(visfatin)是近期新發(fā)現

4、的一種脂肪細胞分泌因子，具有調節(jié)糖代謝、影響內皮功能、調控微循環(huán)形成的功能。但visfatin調控炎癥因子的報道很少。有報道指出visfatin促進單核細胞MMP-9表達。巨噬細胞作為AS斑塊處炎癥因子的主要來源，visfatin對巨噬細胞EMMPRIN等炎癥因子的調控情況并不清楚。明確visfatin對巨噬細胞EMMPRIN及其控制的下游炎癥因子的作用及其機理作用將對動脈粥樣硬化的防治帶來新的思路。
　　 本研究擬通過下述四部

5、分實驗探討鐵負荷過低和visfatin對巨噬細胞和泡沫細胞EMMPRIN及其下游炎癥因子表達的影響及其機理。為尋找通過干擾炎癥途徑，穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的治療藥物提供實驗和理論依據。
　　 第一部分
　　 鐵負荷過低對巨噬細胞、泡沫細胞EMMPRIN表達的影響
　　 目的：觀察鐵負荷過低對巨噬細胞、泡沫細胞EMMPRIN表達、MMP-9表達及活性的影響。
　　 方法：體外誘導THP-1單核細胞轉化為

6、巨噬細胞、泡沫細胞，加入不同濃度鐵離子螯合劑去鐵胺，刺激12h或24h。應用RT-PCR和Westernblot測定巨噬細胞、泡沫細胞中EMMPRIN基因和蛋白表達。Western blot測MMP-9蛋白表達，明膠酶譜法測MMP-9活性。
　　 結果：1．去鐵胺促進巨噬細胞、泡沫細胞EMMPRIN基因水平及蛋白水平表達。2．去鐵胺促進MMP-9蛋白表達水平及活性。以上作用具有統(tǒng)計學意義。
　　 結論：鐵負荷過低增加巨噬

7、細胞、泡沫細胞EMMPRIN及MMP-9的表達及活性，可能會促進心血管事件的發(fā)生。
　　 第二部分
　　 鐵負荷過低促進巨噬細胞、泡沫細胞EMMPRIN表達的機理探討
　　 目的：探討鐵負荷過低上調巨噬細胞、泡沫細胞EMMPRIN表達的機理。研究MAPK信號通路、視黃醛x受體(RXR)及過氧化物酶體增殖劑活化受體γ(PPARγ)在此過程中的作用。
　　 方法：1．為明確MAPK信號通路在DFO上調巨噬細胞

8、、泡沫細胞EMMPRIN中作用，巨噬細胞、泡沫細胞予以MAPK(p38，ERK1/2)信號通路抑制劑預處理1h后，加入或不加入去鐵胺繼續(xù)培養(yǎng)24h，Western blot測定細胞中EMMPRIN蛋白表達。巨噬細胞、泡沫細胞加入鐵離子鰲合劑去鐵胺刺激，Western blot檢測MAPK(p38，ERK1/2)磷酸化水平。2．為明確視黃醛x受體(RXR)天然配體對DFO上調巨噬細胞、泡沫細胞EMMPRIN中作用，巨噬細胞、泡沫細胞予以黃

9、醛x受體(RXR)天然配體9-cis預處理1h后，加入或不加入去鐵胺繼續(xù)培養(yǎng)24h，Western blot測定細胞中EMMPRIN蛋白表達。3．為明確DFO是否通過下調PPARγ表達而促進EMMPRIN表達，細胞予以DFO刺激24h后，Western blot檢測PPARγ表達量。4．為明確DFO是否通過模擬低氧效應促進EMMPRIN表達，巨噬細胞、泡沫細胞經1％低氧刺激24h，Western blot測定細胞中EMMPRIN蛋白表達

10、。
　　 結果：
　　 1．p38MAPK通路抑制劑及RXR配體在本身不影響EMMPRIN表達的同時，抑制去鐵胺對EMMPRIN表到的上調作用。ERK1/2MAPK通路抑制劑無此作用。
　　 2．去鐵胺促進p38MAPK的磷酸化，但不影響PPARγ蛋白表達及ERK1/2MAPK的磷酸化。
　　 3．低氧不影響巨噬細胞、泡沫細胞EMMPRIN表達。
　　 結論：1．p38MAPK參與鐵負荷過低上調巨

11、噬細胞、泡沫細胞EMMPRIN的過程。2．RXR可能參與該過程。3．鐵負荷過低上調巨噬細胞、泡沫細胞EMMPRIN的過程不經其低氧模擬效應或下調PPARγ表達而實現。
　　 第三部分
　　 Visfatin對巨噬細胞EMMPRIN表達的影響
　　 目的：觀察visfatin對巨噬細胞EMMPRIN表達、MMP-9表達及活性的影響。
　　 方法：體外誘導THP-1單核細胞轉化為巨噬細胞，加入不同濃度visf

12、atin，刺激12h或24h。應用RT-PCR和Western blot測定巨噬細胞、泡沫細胞中EMMPRIN基因和蛋白表達。RT-PCR和Western blot測MMP-9蛋白表達，明膠酶譜法測MMP-9活性。
　　 結果：1．visfatin促進巨噬細胞EMMPRIN、MMP-9基因水平及蛋白水平表達。2．Visfatin促進MMP-9蛋白活性。以上作用具有統(tǒng)計學意義。
　　 結論：visfatin增加巨噬細胞EM

13、MPRIN、MMP-9的表達及活性，可能會加劇斑塊的不穩(wěn)定性。
　　 第四部分
　　 Visfatin促進巨噬細胞EMMPRIN表達的機理探討
　　 目的：探討visfatin上調巨噬細胞EMMPRIN、MMP-9表達的機理。研究MAPK信號通路、視黃醛x受體(RXR)及過氧化物酶體增殖劑活化受體γ(PPARγ)在此過程中的作用。
　　 方法：1．為明確MAPK信號通路在visfatin上調巨噬細胞、泡沫

14、細胞EMMPRIN、MMP-9中作用，巨噬細胞予以MAPK(p38，ERK1/2、JNK)信號通路抑制劑預處理1h后，加入visfatin繼續(xù)培養(yǎng)24h，Western blot測定細胞中EMMPRIN、MMP-9蛋白表達。巨噬細胞加入visfatin刺激，Western blot檢測MAPK(p38、ERK1/2、JNK)磷酸化水平。2．為明確視黃醛x受體(RXR)天然配體對visfatin上調巨噬細胞EMMPRIN中作用，巨噬細胞予

15、以黃醛x受體(RXR)天然配體9順式維甲酸預處理1h后，加入visfatin繼續(xù)培養(yǎng)24h，Western blot測定細胞中EMMPRIN及MMP-9蛋白表達。3．為明確PPARγ在visfatin上調EMMPRIN表達中的作用，巨噬細胞予以PPARγ配體預處理1h后，加入visfatin繼續(xù)培養(yǎng)24h，Westernblot測定細胞中EMMPRIN及MMP-9蛋白表達。細胞加入visfatin刺激，Westernblot檢測PPAR

16、γ表達量。
　　 結果：
　　 1．p38MAPK通路抑制劑抑制visfatin對EMMPRIN及MMP-9的上調作用：viafatin促進p38MAPK及ERK1/2MAPK的磷酸化。
　　 2．RXR配體抑制visfatin對EMMPRIN及MMP-9上調作用。
　　 3．PPARγ配體不影響visfatin對EMMPRIN及MMP-9的上調作用。Visfatin不影響PPARγ蛋白表達。