高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ET-1、EMMPRIN中的作用機(jī)制的探討及茶多酚的干預(yù)影響.pdf

1、目的:
　　 糖尿病血管病變是糖尿病患者致殘、致死的首要原因，糖尿病血管病變發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未明了。近年來(lái)越來(lái)越多的研究顯示，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與2型糖尿病的血管病變病理過(guò)程密切相關(guān)[1]。內(nèi)皮素-1（Endothelin-1，ET-1）為較強(qiáng)的縮血管物質(zhì)，是體現(xiàn)內(nèi)皮功能障礙的一個(gè)重要指標(biāo)，在糖尿病血管病變中具有重要的作用[2-4]。細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(extracellularmatrixmetalloprotei

2、naseinducer，EMMPRIN)通過(guò)下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix，ECM)的降解，導(dǎo)致血管外基質(zhì)的病理性重建，進(jìn)而引起糖尿病血管病變。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)通路是細(xì)胞應(yīng)激和損傷反應(yīng)的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[5]，其中與內(nèi)皮細(xì)胞損傷關(guān)系最為密切的是

3、p38MAPK。血管內(nèi)皮細(xì)胞(Vascularendothelialcells，VECs)在高糖的作用下，使p38MAPK信號(hào)通路激活，導(dǎo)致VECs損傷及功能障礙，既可以使ET-1合成增加，引起血管收縮及平滑肌細(xì)胞增殖;又可以使EMMPRI表達(dá)下調(diào)，EMMPRIN通過(guò)一種旁分泌的方式作用于VECs，下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞MMPs的表達(dá)[6-7]，從而減少ECM的降解，造成過(guò)多的ECM在血管外積聚。ET-1、EMMPRIN的共同作用介導(dǎo)了糖尿病血管

4、病變的發(fā)生、發(fā)展。SB203580通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合p38的ATP結(jié)合位點(diǎn)而發(fā)揮抑制作用，是研究p38MAPK通路應(yīng)用最廣泛的抑制劑。研究顯示[8,9]，一定濃度的茶多酚(TeaPolyphenols，TPs)具有對(duì)抗血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而預(yù)防糖尿病血管病變的作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高糖培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs)，觀察HUVECs的活性及ET-1、EMM

5、PRIN的表達(dá)變化，同時(shí)應(yīng)用茶多酚和p38MAPK特異性抑制劑SB203580進(jìn)行干預(yù)，觀察茶多酚對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響，探討其可能機(jī)制，為臨床防治糖尿病血管病變提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為15組:
　　 1、正常對(duì)照組(NG組，含5.5mmol/L葡萄糖)
　　 2、高糖組（HG組，含30.0mmol/L葡萄糖）
　　

6、 3、高滲對(duì)照組（Mannitol組，5.5mmol/L葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇）
　　 4、茶多酚干預(yù)組:
　　 (1)NG+TPs(10mg/L,20mg/L，30mg/L)組（即:NT1,NT2,NT3)
　　 (2)HG+TPs(10mg/L,20mg/L,30mg/L)組（即:HT1,HT2,HT3)
　　 5、p38MAPK特異性抑制劑(SB203580)組:
　　 (1)

7、NG+SB203580(10μmol/L,15μmol/L,20μmol/L)組(即:NP1,NP2，NP3)
　　 (2)HG+SB203580(10μmol/L,15μnol/L,20μmol/L)組(即:HP1,HP2，HP3)
　　 各組細(xì)胞在不同的條件培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h，留取樣本進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用MTT法測(cè)細(xì)胞活性，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)EMMPRINmRNA、ET-1mRNA的表達(dá)，Westernblot檢測(cè)磷

8、酸化p38MAPK蛋白、EMMPRIN蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、相比正常對(duì)照組，高糖組HUVECs活性明顯下降(P＜0.05);高滲對(duì)照組與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05);NG+SB203580（10μmol/L,15μmol/L，20μmol/L）組HUVECs活性均較正常對(duì)照組有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，且三組中以NP2的細(xì)胞活性最強(qiáng)，HG+SB203580（10μmol/L，15

9、μmol/L，20μmol/L）組HUVECs活性均較單純高糖組升高但仍低于正常對(duì)照組(P＜0.05)，三組提高細(xì)胞活性程度相當(dāng)，故SB203580的濃度選擇15μmmol/L作為以下實(shí)驗(yàn)的作用濃度。
　　 2、NT1組HUVECs活性較正常對(duì)照組明顯下降(P＜0.05)，NT2組HUVECs活性與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異(P＞0.05)，NT3組HUVECs活性較正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，HT1組HUVECs活性較單純高

10、糖組下降(P＜0.05)，HT2組HUVECs活性較單純高糖組明顯升高但仍低于正常對(duì)照組(P＜0.05)，HT3組HUVECs活性較單純高糖組明顯升高(P＜0.05)，故TPs的濃度選擇20mg/L（此濃度對(duì)正常糖中的細(xì)胞活性無(wú)影響且能夠降低高糖環(huán)境對(duì)細(xì)胞活性影響）作為以下實(shí)驗(yàn)的作用濃度。
　　 3、相比正常對(duì)照組，高糖組HUVECs的p38MAPK、ET-1呈高表達(dá)(P＜0.05)，EMMPRIN低表達(dá)(P＜0.05);高滲對(duì)

11、照組與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05);NP2組HUVECs的p38MAPK較正常對(duì)照組明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，EMMPRIN、ET-1表達(dá)較正常對(duì)照組無(wú)明顯差異(P＞0.05)，HP2組HUVECs的p38MAPK、ET-1表達(dá)均較單純高糖組下調(diào)(P＜0.05)，EMMPRIN表達(dá)較單純高糖組上調(diào)但仍低于正常對(duì)照組(P＜0.05)。
　　 4、NT2組HUVECs的p38MAPK較正常對(duì)照組明顯下調(diào)，差

12、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，EMMPRIN、ET-1表達(dá)較正常對(duì)照組無(wú)明顯差異(P＞0.05);HT2組HUVECs的p38MAPK、ET-1表達(dá)均較單純高糖組下調(diào)(P＜0.05)，EMMPRIN表達(dá)較單純高糖組上調(diào)但仍低于正常對(duì)照組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、高糖通過(guò)p38MAPK信號(hào)通路抑制HUVECs的活性，20mg/LTPs可以抑制此作用。
　　 2、高糖通過(guò)激活p38MAPK信號(hào)通路