DON致大骨節(jié)病發(fā)病機制研究.pdf

1、目的:
　　 利用Wistar幼鼠、成年鼠和人胚胎軟骨細胞觀察脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)對動物關(guān)節(jié)軟骨的損傷,觀察DON對NO、基質(zhì)金屬蛋白酶等細胞因子的影響以及對關(guān)節(jié)軟骨膠原合成和分解代謝的影響,探討DON與大骨節(jié)病發(fā)病關(guān)系和致病機理,為大骨節(jié)病的防治提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.動物實驗,復(fù)制大骨節(jié)病動物模型,采用灌胃方式投與不同濃度DON毒素,染毒時間為80天,觀察DON致動物關(guān)節(jié)軟骨病理損傷及

2、其機制。
　　 1.1通過HE染色和投射電子顯微鏡,觀察DON導(dǎo)致動物關(guān)節(jié)發(fā)育和鈣化異常的形態(tài)學(xué)改變。
　　 1.2通過免疫組織化學(xué),檢測不同濃度DON處理對動物關(guān)節(jié)軟骨表達MMPs、iNOS、COL2的影響。
　　 2.體外軟骨細胞培養(yǎng):培養(yǎng)人胚胎軟骨細胞,用不同濃度的DON毒素處理軟骨細胞而后分別觀察以上指標(biāo)。
　　 2.1ELISA法檢測培養(yǎng)上清MMP-13,硝酸還原酶法檢測上清液的NO的含量。

3、r>　　 2.2流式細胞術(shù)(FCM)檢測軟骨細胞早期凋亡情況及一氧化氮合酶和Ⅱ型膠原表達的情況。
　　 2.3采用RT-PCR法測定Ⅱ型膠原mRNA和iNOSmRNA的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1.HE染色和投射電子顯微鏡結(jié)果顯示:對照組關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)較均勻、致密,骺板軟骨從骨骺到干骺端結(jié)構(gòu)完好,軟骨基質(zhì)呈弱嗜酸性,細胞排列保持良好的層次;實驗組幼鼠可見軟骨細胞變性,壞死,排列紊亂。健康細胞與受損細胞交互排列,

4、呈現(xiàn)DLD現(xiàn)象。骨小梁數(shù)目減少,且骨小梁變細、連接中斷,立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞;成年鼠可見軟骨細胞變性壞死,有的細胞核溶解消失。電鏡可見基質(zhì)內(nèi)有較小的、大小均勻的、電子密度高的顆粒狀物質(zhì),線粒體腫脹和固縮兼有,并見大小不等的空泡,脊破壞或消失。細胞核形態(tài)不規(guī)則、固縮,染色質(zhì)邊聚,關(guān)節(jié)軟骨膠原網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞。
　　 2.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:(1)Ⅱ型膠原表達量為對照組(7.42±1.12)％,低劑量組(4.79±0.96)％,高劑量組(

5、2.82±0.68)％,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),高劑量組顯著低于對照組(LSD檢驗的t和P值分別為t=9.810,P=0.000);(2)iNOS表達量為對照組(6.90±1.61)％,低劑量組(8.52±1.90)％,高劑量組(11.78±2.51)％,且隨DON濃度增高而增加(P＜0.05);高劑量組明顯高于對照組和低劑量組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);(3)MMP-13表達量為對照組(3.06±1.13)％,低劑量

6、組(6.45±1.56)％,高劑量組(12.47±2.45)％,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,且隨DON濃度增高而增加(P＜0.05)。
　　 3.FCM、RT-PCR、ELISA結(jié)果顯示:(1)DON組早期凋亡率為6.78％～19.05％,高于對照組1.20％,凋亡率隨DON濃度增高而增加(P＜0.05)。(2)DON組上清液NO含量為20.8μmol/L～40.7μmol/L,高于對照組10.2μmol/L(P＜0.05);MMP-13

7、含量為0.25μmol/L～0.56μmol/L,高于對照組0μmol/L(P＜0.05)。(3)DON組軟骨細胞iNOS表達強度為14.8％～56.8％,高于對照組7.1％(P＜0.05)。高劑量DON組(0.4μg/ml和1.0μg/ml)Ⅱ型膠原表達強度為56.7％和52.7％,低于對照組62.2％(P＜0.05)。(4)DON組軟骨細胞內(nèi)iNOSmRNA表達比值為1.07～1.33,高于對照組0.62(P＜0.05)。高劑量DO

8、N組(0.4μg/ml和1.0μg/ml)軟骨細胞內(nèi)Ⅱ型膠原mRNA表達比值為0.83和0.84,低于對照組1.14(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.DON可致Wistar大鼠骨和軟骨損傷,其損傷結(jié)局與骨的生長發(fā)育階段密切相關(guān):在干骺閉合前,除可致軟骨損傷,而且還可致成骨化骨過程發(fā)生障礙,在損傷、修復(fù)、再損傷、再修復(fù)的病理過程中,最終導(dǎo)致干骺早閉,然后導(dǎo)致大骨節(jié)樣病變,發(fā)生肢體短小;在干骺閉合后,可導(dǎo)致軟骨細胞