黑曲霉基因阻斷突變菌株的構(gòu)建及其功能分析.pdf

1、西南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文黑曲霉基因阻斷突變菌株的構(gòu)建及其功能分析姓名：趙春田申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：彭遠義唐國敏20050501西南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文摘璺因(助h)在絲狀真菌中的表達單元構(gòu)建成以pBS為載體的pepAd基因阻斷重組質(zhì)粒pBSAdH，并通過原生質(zhì)體PEG／CaCl2法將HpaI酶切得到的線性同源片段轉(zhuǎn)化到AnigerGICC2773菌株中通過潮霉素抗性平板篩選到89個潮霉索抗性轉(zhuǎn)化子，采用PCR方法從抗

2、性轉(zhuǎn)化子中篩選到1個pepD基因阻斷突變菌株ApepAdl9。外源蛋自漆酶分泌活性分析顯示pepAd基因的阻斷對漆酶的表達分泌沒有顯著的影響。3以AspergittusnigerGICC2773基因組DNA為模板，用PCR方法分別擴增den基因中的上游83lbp和下游998bp兩段DNA序列，將此兩段序列按同一方向分別插入質(zhì)粒pMWI中潮霉素抗性基因(hph)表達單元的5’和3’端。構(gòu)建成derl基因阻斷重組質(zhì)粒pMWderlH。然后采

3、用原生質(zhì)體PEG／CaCl2法，將酶切pMWderlH得到的derl基因阻斷線性片段轉(zhuǎn)化AnigerGICC2773菌株，通過潮霉紊選擇平板得到45個潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子，然后采用PCR方法從這些抗性轉(zhuǎn)化子中篩選到1個由于同源重組產(chǎn)生的derl基因阻斷突變菌株△derI2。外源基因漆酶表達分泌活性分析顯示該突變株的外源蛋白酶漆酶分泌活性明顯下降。然后以AspergillusnigerGICC2773基因組DNA為摸板，用PCR方法擴增der

4、l基因809bp片斷，構(gòu)建成由構(gòu)巢曲霉甘油醛一3一磷酸脫氫酶啟動子(PpgpdA)和色氨酸終止予(TtrpC)引導(dǎo)表達、以amdS為選擇標記的derl重組表達質(zhì)粒pVADS。采用原生質(zhì)體PEG／CaCl2法以pVADS轉(zhuǎn)化derl基因阻斷突變菌株Aderl2，將derI基因重薪整合到其染色體上，獲德derl基因恢復(fù)菌株。外源蛋白漆酶分泌活性分析顯示漆酶話性又恢復(fù)到原出發(fā)菌株AspergillusnigerGICC2773的水平，說明de