血管性血友病因子裂解酶ADAMTS13及其突變體的功能研究.pdf

1、第一部分ADAMTS13及其突變體重組蛋白的純化和鑒定
　　 目的：為了研究ADAMTS13及其突變體的功能，純化并鑒定高純度和生物學(xué)活性的ADAMTS13及其突變體的重組蛋白，為后續(xù)實驗打下重要基礎(chǔ)。
　　 方法：設(shè)計針對ADAMTS13及其突變體基因序列的特異性引物，PCR方法獲得目的DNA基因片段，并克隆至pcDNA3.1-V5-His TOPO載體上。將成功構(gòu)建的ADAMTS13及其突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞

2、，western blot檢測各細(xì)胞的蛋白表達(dá)情況。通過G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞，收集穩(wěn)定細(xì)胞所表達(dá)ADAMTS13及其突變體重組蛋白的培養(yǎng)上清，依次通過Q-fast flow離子結(jié)合柱，Ni-NTA親和層析柱以及分子篩以獲得各種純化的重組蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)染色檢測其純度和分子量大小。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建ADAMTS13及其突變體的表達(dá)載體，并在真核細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。經(jīng)過純化的各種重組蛋白純度很高且分子量大小正確。

3、　　 結(jié)論：體外成功表達(dá)并純化ADAMTS13及其突變體的重組蛋白，為后續(xù)的實驗打下重要基礎(chǔ)。
　　 第二部分ADAMTS13及其突變體功能的體外實驗研究
　　 目的：研究體外剪切力條件下，比較同等特異性活性的ADAMTS13及其突變體delCUB、MDTCS裂解vWF的時間依賴性，酶濃度依賴性和底物濃度依賴性的差異。
　　 方法：應(yīng)用FRETS-VWF73作為底物，檢測ADAMTS13及其突變體的特異性活性

4、。并在剪切力2500rpm（即2.5dyn/cm2）時，分別于不同時間（0，10，20，30和60min），不同酶濃度（特異性活性0,12.5, 25，50，100， 200和300mU/ml）或不同底物VWF多聚體濃度（0,18.75, 37.5, 75, 150, 300nM）條件下，運用1％ agarose凝膠電泳研究ADAMTS13及其突變體裂解VWF多聚體能力的差異。
　　 結(jié)果：在ADAMTS13及其突變體特異性活性

5、相同時，ADAMTS13及其突變體裂解VWF多聚體能力均隨剪切力作用時間延長，酶濃度增加和底物濃度增加呈現(xiàn)最初快速增加之后緩慢增加的趨勢，且ADAMTS13及其突變體各組之間對VWF多聚體的裂解能力均無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）。
　　 結(jié)論：ADAMTS13及其突變體在體外剪切力條件下，裂解VWF多聚體具有相似能力。
　　
　　 第三部分 ADAMTS13及其突變體功能的體內(nèi)實驗研究
　　 目的：研究A

6、DAMTS13及其突變體的重組蛋白在動物體內(nèi)血栓形成過程中功能的差異。
　　 方法：1.ADAMTS13的FL或MDTCS重組蛋白注射入ADAMTS13基因敲除（ADAMTS13-/-）小鼠體內(nèi)，應(yīng)用10％的FeCl3損傷右側(cè)頸動脈，Doppler探頭檢測血管損傷處血栓完全形成的時間。注射PBS和缺失C結(jié)構(gòu)域六個氨基酸的重組蛋白（del6aa）作為對照組。將TSP5-8CUB重組蛋白注射入野生型C57BL/6小鼠體內(nèi)，同樣應(yīng)用1

7、0％的FeCl3損傷右側(cè)頸動脈，Doppler探頭檢測血管損傷處血栓完全形成的時間。比較各種蛋白在FeCl3損傷頸動脈血栓形成動物模型中完全形成栓塞時間的差異。
　　 2.ADAMTS13的FL或MDTCS重組蛋白與熒光（calcein AM）標(biāo)記的血小板分別注射入ADAMTS13-/-小鼠體內(nèi)，應(yīng)用10％的FeCl3損傷腸系膜動脈5min，在體熒光顯微鏡和攝像裝置記錄實時血栓形成和完全栓塞的時間，比較各種蛋白在FeCl3損傷腸

8、系膜動脈血栓形成動物模型中完全形成栓塞時間的差異。
　　 結(jié)果：1.注射PBS, FL, MDTCS或del6aa的ADAMTS13-/-小鼠完全形成栓塞的時間分別為5.3±0.4min，12.7±1.7min，22.0±2.1min，5.9±1.9min，WT小鼠完全形成栓塞的時間為10.0±1.3min， 注射TSP5-8CUB的WT小鼠完全形成栓塞的時間為5.5±2.1min。PBS組與WT組之間，F(xiàn)L組與PBS組之間，M

9、DTCS組與PBS組之間均有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01）, 并且FL組與MDTCS組之間也有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01）。El6aa組與PBS組之間，TSP5-8CUB組與WT組之間均無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）。
　　 2.FeCl3誘導(dǎo)腸系膜動脈損傷形成血栓時間，WT小鼠為12.5±1.2 min，注射PBS的ADAMTS13-/-小鼠為8.5±0.6 min，兩組之間有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01）；FL組為17.1±1.9min