人血管性血友病因子A1區(qū)單克隆抗體的制備和應(yīng)用研究.pdf

1、血管性血友病因子（Von Willebrand Factor，VWF）是一種重要的血漿糖蛋白，是血栓形成過程中的一個重要相關(guān)蛋白，由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，貯存于Weible-Palade小體內(nèi)，骨髓巨核細(xì)胞也合成VWF，貯存在血小板α顆粒內(nèi)的。正常人血漿VWF濃度約為10mg/L。VWF基因位于第12號染色體，長178kb，由52個外顯子與51個內(nèi)含子組成。
　　 VWF分子包含4個不同的功能結(jié)構(gòu)域，其排列為NH2-D1-D2-D'

2、-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-COOH。A1區(qū)為血小板膜糖蛋白（Gp）Ib結(jié)合部位，A3區(qū)為膠原結(jié)合部位，C1區(qū)為血小板GpⅡb/Ⅲa結(jié)合部位，D'區(qū)為因子Ⅷ結(jié)合部位。其中A1區(qū)是瑞斯托霉素（Ristocetin）、博托霉素（Botrocetin）的結(jié)合位點(diǎn)，也是肝素、Ⅵ型膠原的結(jié)合位點(diǎn)，是VWF與血小板結(jié)合的關(guān)鍵部位。
　　 VWF多聚體是起著連接血小板和內(nèi)皮下基質(zhì)的橋梁作用，通過內(nèi)皮下基質(zhì)膠原

3、同VWF-A3區(qū)的結(jié)合，以及GpIbα同VWF-A1區(qū)的結(jié)合。VWF同血小板平時共存于循環(huán)血液中，不發(fā)生相互作用，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷時，如外源性分子，蛇毒蛋白博托霉素的作用-內(nèi)皮下膠原等細(xì)胞外基質(zhì)暴露，與血液中VWF-A3區(qū)結(jié)合，使VWF構(gòu)型發(fā)生改變，或者在高剪切力條件下VWF構(gòu)型發(fā)生改變，暴露了與血小板GpIb結(jié)合的位點(diǎn)，即VWF-A1區(qū)，從而使血小板不斷附著在受損血管壁部位，黏附的血小板或受到血小板激活劑（如膠原、凝血酶等）作用

4、的血小板會發(fā)生一系列反應(yīng)，包括花生四烯酸代謝，產(chǎn)生血栓烷A2（TXA2）和釋放出細(xì)胞內(nèi)顆粒內(nèi)容物（ADP等），最后導(dǎo)致血小板GpⅡb/Ⅲa復(fù)合物的構(gòu)型改變，形成粘附分子受體，并通過與纖維蛋白原的結(jié)合而使血小板之間相互黏附、聚集成團(tuán)，在血管破損處形成早期血栓。
　　 血栓性疾病一直就是危害人類健康的重要疾病之一，抗血栓治療近年來也取得了巨大的進(jìn)步，主要是抗血小板CpⅡb/Ⅲa藥物的出現(xiàn)，如ReoPro，此類藥物作用于血小板聚集的最

5、終途徑，抑制血小板GpⅡb/Ⅲa同纖維蛋白原的結(jié)合，從而阻止血栓的形成，但是這類藥物的缺點(diǎn)也很突出，就是直接抑制了血小板的聚集，這樣的結(jié)果就是會產(chǎn)生較高的出血傾向。
　　 2002年，Science雜志發(fā)表了GpIbα同VWF-A1區(qū)復(fù)合物結(jié)構(gòu)一文，明確了GpIbα同VWF-A1區(qū)結(jié)合位點(diǎn)，指出了這一結(jié)合位點(diǎn)對血小板黏附的影響，對今后開發(fā)新型抗血栓藥物提供了新思路。因此抗VWF-A1區(qū)單抗的研制將對血小板黏附的機(jī)理研究，血栓形成

6、早期的機(jī)理研究以及抗血栓藥物的研制提供有力的工具。
　　 我們用自己構(gòu)建的VWF-A1區(qū)表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)。VWF-A1區(qū)原核蛋白，經(jīng)Ni-NTA Agarose凝膠柱純化，將rVWF-A1作為抗原，免疫Balb/c小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)獲得了三株抗人VWF-A1區(qū)單克隆抗體，分別命名為SZ-129、SZ-130、SZ-131。瓊脂糖雙擴(kuò)散鑒定三株單抗均為IgG1亞類；ELISA法測定其腹水效價分別約為1×10-5、2×10-5、5

7、×10-5；經(jīng)Protein G-Sepharose4B親和層析柱純化所得的抗體濃度分別為2mg/ml、1.26mg/ml、2.38mg/ml。ELISA和Western blot顯示SZ-129、SZ-130和SZ-131都能與原核表達(dá)的rVWF-A1和純化的人血漿VWF蛋白特異結(jié)合；免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，SZ-129和SZ-130都能特異的結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞中的VWF；血小板聚集試驗(yàn)顯示，SZ-129和SZ-130能抑制瑞斯托霉素誘導(dǎo)的

8、血小板聚集，并且該抑制具有一定的量效關(guān)系。SZ-129能抑制博托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集；SZ-129和SZ-130都不能抑制ADP和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集。而VWF同GpIb結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)表明，SZ-129和SZ-130作用于VWF后，抑制了VWF同血小板GpIbα的結(jié)合；流動小室實(shí)驗(yàn)表明，SZ-129作用于VWF后，抑制了VWF同血小板的結(jié)合，減少了血小板在固相化VWF上的黏附。以上試驗(yàn)初步顯示，SZ-129、SZ-130、SZ-131作用

9、于VWF-A1區(qū)，SZ-129和SZ-130能抑制VWF與血小板GpIb的結(jié)合，特別是SZ-129，在體外能減少血小板黏附于VWF，通過改造，具有成為抗血小板黏附，甚至是抗血栓藥物的可能。
　　 VWF上的各個結(jié)構(gòu)域具備的結(jié)合活性目前基本已經(jīng)明確，如今VWF的研究熱點(diǎn)是膠原-VWF-GpIb軸，抑制膠原同VWF的結(jié)合，或者抑制VWF同Gpro的結(jié)合，都能較好的抑制血小板黏附，從而阻礙血小板聚集，減少血栓的形成。我們把目標(biāo)放在VW