版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、ADAMTS13,又名血管性血友病因子裂解蛋白酶,其主要功能是特異性裂解血管性血友病因子(VWF),從而調(diào)節(jié)抑制VWF介導(dǎo)的血小板血栓形成。2001年人ADAMTS13的基因首次被克隆報(bào)道,并定位于9號(hào)染色體長(zhǎng)臂端(9q34),基因全長(zhǎng)37kb,主要由29個(gè)外顯子組成,其基因表達(dá)開放閱讀框?yàn)?284bp,編碼1427個(gè)氨基酸。ADAMTS13蛋白主要由9個(gè)結(jié)構(gòu)功能域組成,具體分別包括:信號(hào)肽、前導(dǎo)肽、金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、去整合素結(jié)構(gòu)域、凝
2、血酶敏感蛋白1(TSP1)第1基序、富半胱氨酸區(qū)域、間隔區(qū)、凝血酶敏感蛋白1(TSP1)第2-8重復(fù)基序、補(bǔ)體結(jié)合區(qū)域(CUB),其中信號(hào)肽和前導(dǎo)肽在成熟ADAMTS13蛋白細(xì)胞分泌前被切掉。目前研究證實(shí),ADAMTS13酶活性嚴(yán)重降低可以導(dǎo)致血栓性血小板減少性紫癜(TTP)的發(fā)病,不僅在TTP中,近年來在大多數(shù)血栓性傾向的疾病當(dāng)中均檢測(cè)到ADAMTS13酶活性的不同程度缺失,ADAMTS13基因的缺陷或其自身抗體的存在是已知的可以導(dǎo)致
3、酶功能活性嚴(yán)重缺失的主要病理因素,那么是否還有其他因素可以造成ADAMTS13酶活性的減少,最終導(dǎo)致血漿VWF降解程度的受損?對(duì)于ADAMTS13蛋白功能基礎(chǔ)調(diào)節(jié)的研究一直是血栓性疾病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。我們?cè)谇捌谙嚓P(guān)工作的基礎(chǔ)之上,進(jìn)一步深入研究分析了ADAMTS13酶活性的一些調(diào)節(jié)因素,以及初步探討了ADAMTS13與微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互關(guān)系,同時(shí)建立了一種新型的ADAMTS13的酶活性檢測(cè)方法。
一、ADAMTS
4、13蛋白C-末端結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)自身酶活性的研究
目前研究表明,ADAMTS13在酶切底物VWF的過程中存在著廣泛的相互結(jié)合,金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域是ADAMTS13蛋白酶活性發(fā)揮的關(guān)鍵中心,而去整合素結(jié)構(gòu)域、凝血酶敏感蛋白1(TSP1)第1基序、富半胱氨酸區(qū)域、間隔區(qū)這些結(jié)構(gòu)域?qū)τ陟o態(tài)條件下ADAMTS13酶活性的發(fā)揮有著重要的影響,尤其是間隔區(qū),目前已經(jīng)證實(shí)在多數(shù)獲得性TTP患者當(dāng)中均檢測(cè)到間隔區(qū)位點(diǎn)自身抗體的存在。ADAMTS1
5、3蛋白C-末端結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為對(duì)于其酶活性的貢獻(xiàn)較小,然而C-末端CUB區(qū)域卻是ADAMTS13在該家族中所具有的特有性結(jié)構(gòu)域,近年來,有研究提示重組表達(dá)的ADAMTS13 C-末端蛋白多肽在高剪切力條件下可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制ADAMTS13酶活性,而且C-末端的TSP1重復(fù)基序與CUB區(qū)可能共同對(duì)于ADAMTS13酶活性的發(fā)揮起重要作用。因此,我們對(duì)于ADAMTS13蛋白C-末端結(jié)構(gòu)域功能進(jìn)行了初步的研究。
首先,我們利用含人AD
6、AMTS13全長(zhǎng)及去C-末端TSP8+CUB區(qū)截短型基因序列質(zhì)粒pSecTag-ADAMTS13-His,經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)真核轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,經(jīng)潮霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)rADAMTS13的兩株細(xì)胞株,收集無血清培養(yǎng)上清,濃縮后上清經(jīng)過Ni-NTA Agarose柱子進(jìn)行純化,之后經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定OD280計(jì)算蛋白濃度以及Westerblot鑒定。結(jié)果表明:我們獲得了全長(zhǎng)野生型及C-末端截短型rADAMTS13蛋白,初步OD280計(jì)算蛋白濃度
7、(野生型及截短型rADAMTS13蛋白分別為116ug/ml,126ug/ml),Westerblot結(jié)果也證實(shí)其特異性,重組表達(dá)的蛋白分子大小與預(yù)期基本一致。
其次,我們以純化的血漿VWF蛋白作為檢測(cè)底物,分別在靜態(tài)或動(dòng)態(tài)渦流條件下,利用R-CBA法以及Reduced-SDS-PAGE法檢測(cè)了這兩種rADAMTS13蛋白的酶活性,同時(shí)利用ELISA方法檢測(cè)了這兩種rADAMTS13蛋白與VWF底物的結(jié)合能力。結(jié)果表明:在
8、靜態(tài)尿素變性條件下,Reduced-SDS-PAGE法檢測(cè)酶切后獲得的VWF176KD的特異性裂解片段來反應(yīng)酶活性的大小,發(fā)現(xiàn)野生型及截短型rADAMTS13蛋白均能對(duì)VWF進(jìn)行切割,但去C-末端的截短型rADAMTS13蛋白酶活性較野生型有所增強(qiáng),R-CBA法定量檢測(cè)酶活性提示,野生型及截短型rADAMTS13蛋白的平均活性為61.23±7.67%、92.84±0.38%。二者之間有顯著差異(p<0.01);ELISA法檢測(cè)分析靜態(tài)條
9、件下rADAMTS13與包被在96孔板上的VWF結(jié)合能力,發(fā)現(xiàn)無論是野生型還是截短型rADAMTS13蛋白,結(jié)合VWF的能力均隨著蛋白濃度的增高而增強(qiáng),但截短型rADAMTS13蛋白結(jié)合VWF的能力明顯高于野生型;然而在高剪切力條件下,僅全長(zhǎng)野生型rADAMTS13蛋白能對(duì)VWF進(jìn)行切割,但酶切能力較靜態(tài)條件下有所減弱,平均活性為41.34±18.06%,截短型rADAMTS13蛋白在高剪切力條件下幾乎檢測(cè)不到活性,活性低于5%。
10、> 二、TSP1調(diào)節(jié)ADAMTS13酶活性的研究
血小板敏感蛋白-1(Thrombospondin-1,TSP1),同VWF一樣,也儲(chǔ)存于血小板α-顆粒,有研究發(fā)現(xiàn),TSP1可以保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面VWF介導(dǎo)的血小板血栓形成,并推測(cè)認(rèn)為TSP1很可能是通過與vWFA3區(qū)的有效結(jié)合,從而競(jìng)爭(zhēng)抑制了ADAMTS13酶活性的發(fā)揮。而ADAMTS13與VWFA區(qū)均存在著廣泛的結(jié)合,尤其是VWFA2區(qū),考慮本實(shí)驗(yàn)室初期已經(jīng)制備
11、表達(dá)了VWFA1、A3區(qū)蛋白,我們進(jìn)一步構(gòu)建表達(dá)了VWFA2區(qū)蛋白,并對(duì)TSP1調(diào)節(jié)ADAMTS13酶活性具體機(jī)制做初步的分析。
首先,我們以含人vWF全長(zhǎng)cDNA序列質(zhì)粒pSVvWF為模板,采用A2區(qū)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,直接擴(kuò)增獲得VWFA2區(qū)基因片段,并用T4 DNA連接酶連接構(gòu)建了pUCm-T-VWFA2重組質(zhì)粒,之后雙酶切鑒定及測(cè)序分析,結(jié)果均表明克隆的A2區(qū)基因片段是完全正確的,于是我們?cè)俅纬晒B接構(gòu)建了P
12、QE30-VWFA2重組表達(dá)質(zhì)粒,利用該表達(dá)質(zhì)粒在M15表達(dá)菌中進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)Ni-NTA Agarose柱子對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白進(jìn)行了純化,純化后電泳并經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色鑒定,可見約25 kD單一的蛋白條帶,分子量與我們預(yù)期表達(dá)的VWFA2區(qū)蛋白分子量相一致。結(jié)果證明我們獲得了純度很高的VWFA2區(qū)原核表達(dá)蛋白,這為進(jìn)一步研究其ADAMTS13酶蛋白的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
其次,我們分別以純化的血漿全長(zhǎng)VWF蛋白、VWFA
13、1、A2、A3區(qū)為檢測(cè)底物,R-CBA以及Westerblot分析觀察TSP1直接對(duì)ADAMTS13酶切血漿全長(zhǎng)VWF蛋白、A2區(qū)的影響,ELISA觀察TSP1直接對(duì)ADAMTS13結(jié)合血漿全長(zhǎng)VWF蛋白、各A區(qū)蛋白的影響。結(jié)果提示:在生理最大TSP1濃度條件下,其可以顯著抑制ADAMTS13與VWF的相互結(jié)合;TSP1直接抑制ADAMTS13對(duì)VWF的裂解,最大抑制率可達(dá)70%;ADAMTS13與TSP1在VWF A2和A3區(qū)存在競(jìng)爭(zhēng)
14、性結(jié)合位點(diǎn),TSP1可以直接抑制ADAMST13對(duì)VWFA2區(qū)蛋白的裂解。
三、ADAMTS13與微血管內(nèi)皮細(xì)胞關(guān)系的研究
同肝臟星狀細(xì)胞一樣,血管內(nèi)皮細(xì)胞也是血漿ADAMTS13產(chǎn)生的主要來源,這一點(diǎn)已經(jīng)得到國(guó)外研究的證實(shí)在,但這些研究都集中的一些大血管內(nèi)皮細(xì)胞中,而對(duì)于微血管細(xì)胞中ADAMTS13的表達(dá)研究較少;ADAMTS13調(diào)節(jié)VWF介導(dǎo)的血小板血栓形成過程又主要發(fā)生在微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面,那么對(duì)于微血
15、管內(nèi)皮細(xì)胞本身是否參與其局部血管周圍ADAMTS13酶活性的改變呢?另外,有報(bào)道提示ATRA可以通過下調(diào)細(xì)胞內(nèi)組織因子(TF)的表達(dá),以及促進(jìn)其血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)、組織型纖溶酶原激活物(t-PA)等基因的表達(dá),從而改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的高凝狀態(tài),那么ATRA對(duì)于微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)分泌ADAMTS13與VWF平衡是否也存在影響?因此,我們帶著這些問題對(duì)ADAMTS13與微血管內(nèi)皮細(xì)胞關(guān)系做了初步的研究。
首先,我們分別運(yùn)用流式
16、細(xì)胞技術(shù)和免疫熒光顯微鏡直接檢測(cè)觀察了微血管內(nèi)皮細(xì)胞株IIMEC-1中ADAMTS13表達(dá)情況,同時(shí)我們也利用免疫熒光顯微鏡檢測(cè)觀察了HMEC-1中VWF的表達(dá)分布情況,發(fā)現(xiàn)在微血管內(nèi)皮細(xì)胞株中的確存在大量ADAMTS13表達(dá),并且內(nèi)皮細(xì)胞中ADAMTS13與VWF表達(dá)的分布有部分相同疊加區(qū)域,這一點(diǎn)與國(guó)外研究者在一些大血管內(nèi)皮細(xì)胞株中報(bào)道的情況相一致;我們也運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)初步檢測(cè)觀察了重組ADAMTS13蛋白與微血管內(nèi)皮細(xì)胞株HME
17、C-1膜表面相互作用,我們的檢測(cè)結(jié)果提示ADAMTS13可以與微血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面相結(jié)合,這種結(jié)合可能并不依賴于ADAMTS13的C末端,并且這種結(jié)合可以被TSP1蛋白所阻斷。
其次,我們分別利用實(shí)時(shí)定量PCR以及Westerblot技術(shù),在基因和蛋白水平證實(shí)了ATRA可以上調(diào)微血管內(nèi)皮細(xì)胞中ADAMTS13的表達(dá),從而增加分泌上清中ADAMTS13的酶活性。同時(shí),我們也進(jìn)一步證實(shí)了部分炎性因子如TNF-α可以抑制血管內(nèi)皮
18、細(xì)胞ADAMTS13的表達(dá),這與國(guó)外報(bào)道基本一致。我們的結(jié)果也表明,ATRA同樣可以逆轉(zhuǎn)TNF-α對(duì)ADAMTS13表達(dá)的抑制效應(yīng),而ATRA對(duì)于HMEC-1中VWF的分泌并無影響。因此,我們認(rèn)為ATRA可以通過有效改善血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)分泌ADAMTS13與VWF平衡的影響,從而改善機(jī)體的高凝狀態(tài)。
四、一種新型ADAMTS13酶活性檢測(cè)方法的建立及其評(píng)價(jià)
ADAMTS13酶活性的檢測(cè)不僅僅對(duì)于TTP的臨床診
19、斷有重要價(jià)值,而且可能對(duì)于TTP的預(yù)后評(píng)估也有指導(dǎo)意義。然而目前現(xiàn)有的一些檢測(cè)方法均存在不同程度的缺陷,無法推廣,鑒于此,繼續(xù)研究開發(fā)新型ADAMTS13酶活性檢測(cè)方法仍然是有必要的。我們利用我所特有的兩株新開發(fā)的VWF單克隆抗體--分別是針對(duì)VWFA1及A3區(qū)的單抗SZ129、SZ125,以血漿自身的VWF作為底物,建立了一種新型的ADAMTS13酶活性檢測(cè)方法,并對(duì)其進(jìn)行了初步的評(píng)價(jià)和臨床應(yīng)用。我們的結(jié)果表明:我們建立了一種新型的A
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- ADAMTS13及其C1423T基因多態(tài)性與TSP1在老年急性腦梗塞中的研究.pdf
- VWF和ADAMTS13相互作用機(jī)制的研究.pdf
- vWF活性和ADAMTS13活性在膿毒癥患者中的臨床意義.pdf
- 流動(dòng)狀態(tài)下ADAMTS13羧基端的功能研究.pdf
- WXXW基序?qū)DAMTS13分泌及功能的影響.pdf
- ADAMTS13及炎癥因子在腎臟疾病的臨床與基礎(chǔ)研究.pdf
- 重組ADAMTS13減輕腦缺血后應(yīng)用tPA所致的腦出血.pdf
- 血管性血友病因子裂解酶ADAMTS13及其突變體的功能研究.pdf
- 多克隆抗體介導(dǎo)的獲得性ADAMTS13缺陷小鼠模型的建立.pdf
- 急性腦梗塞患者血漿vWF和ADAMTS13抗原水平變化的相關(guān)研究.pdf
- 免疫性血小板減少癥患者血小板計(jì)數(shù)對(duì)ADAMTS13和VWF活性的影響.pdf
- 造血干細(xì)胞移植過程中ADAMTS13與VWF的檢測(cè)及其臨床意義.pdf
- ACS患者血漿vWF、ADAMTS13水平與冠脈病變程度的相關(guān)性研究.pdf
- 血栓性血小板減少性紫癜發(fā)病機(jī)理及腫瘤細(xì)胞中ADAMTS13表達(dá)的研究.pdf
- ADAMTS13依賴性血管性血友病因子水解相關(guān)影響因素的研究.pdf
- Y盒結(jié)合蛋白-1C末端結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)血管新生的機(jī)制研究.pdf
- TSP2-8CUB1+2片段影響流動(dòng)狀態(tài)下ADAMTS-13活性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 擬南芥G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(AtRGS1)N-末端、C-末端結(jié)構(gòu)域在葡萄糖和ABA介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的作用.pdf
- TSP2-8CUB1+2片段影響ADAMTS-13分泌方向的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 蛋白CMS SH3結(jié)構(gòu)域溶液結(jié)構(gòu)的測(cè)定及其與c-Cbl C-末端多肽相互作用的研究.pdf
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論