人在體細樣胞周期核心機制多性.pdf

1、第一部分
　　 目的：將正常的胃、腸及口腔黏膜上皮組織制備成高質(zhì)量的單細胞懸液，可供流式細胞儀檢測；并建立人類在體細胞的細胞增殖周期研究模型。
　　 方法：應(yīng)用不同濃度的胃蛋白酶和Dispase嘗試去除胃、腸、口腔粘液和分離獲得粘膜層后，再使用機械剪碎法制備成單細胞懸液并用濾網(wǎng)過濾細胞；另外部分標(biāo)本采用棉簽直接刮取正常人群的口腔黏膜上皮細胞，并用濾網(wǎng)過濾之。然后用流式DNA直方圖來驗證獲得的單細胞的各周期比例，進一步采用

2、Ki67/DNA雙參數(shù)法檢測細胞的增殖能力。對照組是單用機械剪碎法和單用酶消化法以及人類外周血淋巴細胞。
　　 結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)0.05-0.1％的胃蛋白酶濃度和1.2-2.4 u/ml的Dispase濃度能夠較好的去除胃、腸、口腔粘液而獲得粘膜層，然后剪碎并吹打，制備成胃、腸、口腔粘膜上皮細胞的單細胞懸液；用棉簽刮取的口腔黏膜上皮組織濾過之后直接成為單細胞懸液，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)較完整，細胞數(shù)量大于1×106，細胞存活率大

3、于90％，從而都能夠采用流式技術(shù)進行單細胞分析。流式DNA含量法檢測胃、腸、口腔黏膜上皮細胞G1期約占80％～82％，S期約占11％～12％，Ki67/DNA雙參數(shù)法檢測胃、腸、口腔黏膜上皮組織的增殖率分別為11.67％、27.79％、23.48％，均低于體外培養(yǎng)的淋巴細胞。
　　 結(jié)論：利用胃蛋白酶和Dispase能夠去除胃、腸、口腔粘液，較容易獲得高質(zhì)量的胃、腸、口腔粘膜上皮細胞的單細胞懸液，樣本完全適合FCM分析，結(jié)果滿意

4、。胃、腸、口腔粘膜上皮細胞具有明顯的細胞分裂周期，適合成為人類在體細胞的細胞增殖周期研究模型。
　　
　　 第二部分
　　 目的：以胃、腸和口腔黏膜上皮細胞為研究對象，研究人類正常在體細胞的細胞周期核心調(diào)控因子的表達情況。
　　 方法：采用Western blot分析各種細胞周期調(diào)控因子Cyclins（A，B1，D1，E），CDKs（CDK1，2，4，6）、CKIs（P27，P21，P19，P16）和R

5、b的表達；并與正常人外周血淋巴細胞（PBL）和體內(nèi)骨髓單個核細胞（MNC）作為對比分析。
　　 結(jié)果：Western blot分析結(jié)果顯示：口腔黏膜上皮細胞（OME）中cyclin D1明顯表達，cyclin A、cyclin B1和cyclin E無表達或微弱表達；胃、腸黏膜上皮細胞（GME和IME）中cyclin A、cyclin B1、cyclin D3和cyclin E均無表達或微弱表達。口腔黏膜上皮細胞中CDK2、CD

6、K4和CDK6明顯表達，而CDK1無表達或微弱表達；胃腸黏膜上皮細胞中CDK2明顯表達，并且胃黏膜上皮細胞中CDK2的表達比腸黏膜上皮細胞的表達要低，而CDK1、CDK4和CDK6無表達或微弱表達?？谇火つど掀ぜ毎衟19、p21和p27明顯表達，而p16無表達或微弱表達；胃腸黏膜上皮細胞中p19明顯表達，而p16、p21和p27無表達或微弱表達。胃、腸、口腔黏膜上皮細胞中Rb無表達或微弱表達。
　　 結(jié)論：細胞周期調(diào)控因子體內(nèi)

7、細胞與體外培養(yǎng)細胞中的表達以及體內(nèi)細胞與細胞之間的表達并不完成相同，提示人類在體細胞周期核心機制可能存在多樣性。
　　
　　 第三部分
　　 目的：探討人類在體細胞（胃、腸、口腔黏膜上皮細胞）的細胞周期核心調(diào)控機制，即Cyclins時相性起伏及CDKs序列激活規(guī)律。
　　 方法：Cyclins時相性表達規(guī)律：Post-sorting Western blot（分選后蛋白電泳技術(shù)）檢測四種Cyclins在細

8、胞周期不同時相中的表達。CDKs序列激活規(guī)律：Post-sorting Western blot（分選后免疫共沉淀技術(shù)）分析Cyclins和CDKs的相互結(jié)合規(guī)律。陽性對照采用正常人外周血PHA刺激培養(yǎng)的淋巴細胞（PBL）和體內(nèi)骨髓單個核細胞（MNC）。
　　 結(jié)果：Cyclins時相性表達規(guī)律：體內(nèi)OME的表達規(guī)律是：Cyclin D1在G1早期合成，S期和G2/M期開始下降；Cyclin E、Cyclin A和 Cyclin

9、 B1無表達或在G1期有微弱表達。體內(nèi)GME和IME的表達規(guī)律是：Cyclin D1、Cyclin E、Cyclin A和 Cyclin B1無表達或在G1期有微弱表達。CDKs序列激活規(guī)律：在OME中，在G1、S、G2/M期，Cyclin D1均與CDK2、CDK4、CDK6結(jié)合；在G1期，cyclin D1/CDK4/CDK6結(jié)合最多；在G2/M期，cyclin D1/CDK2結(jié)合最多。在GME和IME中，在G1、S、G2/M期，C