豚鼠Ⅱ細(xì)鈣關(guān)肽型前庭毛胞降素基因相研作用機(jī)制的究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：豚鼠前庭毛細(xì)胞的改良分離方法
　　 目的：改良原有的前庭毛細(xì)胞分離方法，建立一種快速獲得更多數(shù)量和更高活性的前庭毛細(xì)胞的方法。
　　 方法：將耳廓反射正常的豚鼠20只(體重250-300g)，每次實(shí)驗(yàn)用兩只豚鼠，共取得四個(gè)聽泡分為隨機(jī)分為A、B、C、D 四組。A組：膠原酶ⅠA+鋼針+普通玻璃滴管吹打；B組：膠原酶ⅠA+鋼針+微量加樣器吹打；C組：膠原酶ⅠA+微量加樣器吹打；D組

2、：胰酶分離+微量加樣器吹打。通過光鏡、膜片鉗等方法評(píng)價(jià)細(xì)胞狀態(tài)。
　　 結(jié)果：A組：平均每耳分離出單離VHCs Ⅰ(Ⅰ型前庭毛細(xì)胞)73.1個(gè)，VHCs Ⅱ(Ⅱ型前庭毛細(xì)胞)7.1個(gè)。纖毛損失細(xì)胞率(以纖毛缺失大于3/4 為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù))：VHCs Ⅰ為28[％]，VHCs Ⅱ?yàn)?5[％]。3小時(shí)后水腫細(xì)胞率：VHCs Ⅰ為28[％]，VHCs Ⅱ?yàn)?7[％]。B組：平均每耳分離出單離VHCs Ⅰ69.2個(gè)，VHCs Ⅱ6.4個(gè)。纖

3、毛損失細(xì)胞率：VHCs Ⅰ為18[％]，VHCs Ⅱ?yàn)?1[％]。3小時(shí)后水腫細(xì)胞率：VHCs Ⅰ為19[％]，VHCs Ⅱ?yàn)?5[％]。C組：平均每耳分離出單離VHCs Ⅰ107.9個(gè)，VHCs Ⅱ毛細(xì)胞14.5個(gè)。纖毛損失細(xì)胞率：VHCs Ⅰ為18[％]，VHCs Ⅱ?yàn)?8[％]。3小時(shí)后水腫細(xì)胞率：VHCs Ⅰ為10[％]，VHCs Ⅱ?yàn)?7[％]。D組：平均每耳分離出單離VHCs Ⅰ102.8個(gè)，VHCs Ⅱ毛細(xì)胞12個(gè)。纖毛損

4、失細(xì)胞率：VHCs Ⅰ為20[％]，VHCs Ⅱ?yàn)?9[％]。3小時(shí)后水腫細(xì)胞率：VHCs Ⅰ為13[％]，VHCs Ⅱ?yàn)?8[％]。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)所采用的“膠原酶ⅠA 加微量加樣器吹打”分離的細(xì)胞，清潔玻璃培養(yǎng)皿中淺液體沉淀，能夠在更短的時(shí)間，提供較以往傳統(tǒng)方法更多數(shù)目，更高質(zhì)量的單個(gè)前庭毛細(xì)胞。
　　 第二部分：豚鼠Ⅱ型前庭毛細(xì)胞 CGRP 敏感性ATP 依賴性鉀電流
　　 目的：研究豚鼠前庭終器Ⅱ型前

5、庭毛細(xì)胞(VHCs Ⅱ)降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitoningene-related peptide，CGRP)敏感性電流的特性。
　　 方法：應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測新鮮單離的豚鼠前庭終器Ⅱ型前庭毛細(xì)胞CGRP敏感性鉀電流的離子特性及其藥理學(xué)特點(diǎn)。
　　 結(jié)果：1.-50mV 鉗制電壓下，細(xì)胞外CGRP激活一緩慢持久的外向性電流，其I-V 曲線反轉(zhuǎn)電位為(-65±10) mV，有內(nèi)向整流性質(zhì),其效應(yīng)呈濃度依賴性,半數(shù)

6、激活濃度為39.8nM。2.該電流對CGRP 受體阻斷劑CGRP8-37敏感，PA2 值為7.5>7，提示該受體為CGRP1型受體。3.不同鈣濃度對CGRP電流沒有明顯影響。4.該電流可被胞外RPcAMP,Glibenclamide 明顯抑制，對胞外TEA(tetraethylammonium)不敏感。
　　 結(jié)論：細(xì)胞外CGRP通過CGRP1型受體經(jīng)由AC-cAMP-PKA 系統(tǒng)激活豚鼠前庭終器Ⅱ型前庭毛細(xì)胞ATP 依賴性鉀通