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文檔簡(jiǎn)介
1、本研究包括兩部分:
第一部分:大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化與成骨鑒定
目的:觀察及鑒定體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并向成骨方向誘導(dǎo)分化
方法:取健康成年SD大鼠,全骨髓貼壁培養(yǎng)法獲取MSCs,通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察其形態(tài)學(xué)特征和生長(zhǎng)狀況,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線;培養(yǎng)第2 代MSCs接種后,實(shí)驗(yàn)組加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液,對(duì)照組加入等量完全培養(yǎng)液,待MSCs生長(zhǎng)至匯合時(shí),進(jìn)行堿性磷酸酶染色。
2、結(jié)果:分離培養(yǎng)的細(xì)胞在第10~12代以前生長(zhǎng)性狀穩(wěn)定,呈成纖維細(xì)胞形態(tài)貼壁生長(zhǎng),增殖能力強(qiáng);原代培養(yǎng)3~4d后細(xì)胞開始增殖,約7~14d可匯合成片,傳代周期約為5~9d;成骨誘導(dǎo)分化后12~16d可出現(xiàn)較多散在的致密圓形礦化結(jié)節(jié),堿性磷酸酶染色可呈陽(yáng)性,對(duì)照組則未出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié),ALP活性較弱甚至無(wú)顯色。
結(jié)論:分離培養(yǎng)的細(xì)胞成分較為單一,具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特性,可用于下一步藥物實(shí)驗(yàn)。
第二部分:恩再適對(duì)大鼠
3、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖凋亡與成骨分化的影響
目的:探討恩再適對(duì)MSCs增殖凋亡及向成骨細(xì)胞分化的可能影響機(jī)制。
方法:按不同的藥物劑量,將恩再適分為空白對(duì)照組、培養(yǎng)液藥物終濃度為0.1U/ml(低濃度組)、0.5U/ml(中濃度組)和1.0U/ml(高濃度組)共四組,分別干預(yù)培養(yǎng)生長(zhǎng)于96孔板中的P3 代MSCs,在第1、3、5、7、9、11d 進(jìn)行MTT 測(cè)定,第2、4、6、8、10、12d 進(jìn)行堿性磷酸酶活
4、性測(cè)定;分別干預(yù)培養(yǎng)生長(zhǎng)于六孔板中的P3 代MSCs共3d,進(jìn)行流式DNA周期分析及Annexin V-FITC/PI 雙標(biāo)凋亡分析;分別干預(yù)培養(yǎng)生長(zhǎng)于六孔板中的P3 代MSCs,在第3、7、12d 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)Ⅰ型膠原(α2)鏈Col-I mRNA、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)mRNA及骨鈣素(OC)mRNA表達(dá)。
結(jié)果:在干預(yù)早期(<1周)恩再適對(duì)MSCs的增殖分化均無(wú)明顯影響,甚至促進(jìn)
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