人肝癌胞VEGFA異構基因剪切體異達義研差性表及其意的初步究.pdf

1、本研究包括三部分：
　　 第一部分：VEGF165和VEGF165b真核表達質(zhì)粒的構建和鑒定
　　 目的：構建人VEGF165和VEGF165b 真核表達質(zhì)粒，為研究VEGF165和VEGF165b 蛋白的功能奠定基礎。
　　 方法：設計引物，利用RT-PCR 獲得VEGF165的cDNA，BamHI和EcoRI 限制性內(nèi)切酶雙酶切后與真核表達載體pcDNA3.0 連接，氨芐青霉素篩選，酶切鑒定和測序鑒定。利用構

2、建好的VEGF165質(zhì)粒，采取酶切重組的方法構建VEGF165b，氨芐青霉素篩選，酶切鑒定和測序鑒定。
　　 結果：經(jīng)酶切鑒定和測序鑒定顯示，兩個重組質(zhì)粒插入基因片段正確，無突變。
　　 結論：VEGF165和VEGF165b的真核表達質(zhì)粒構建成功。
　　 第二部分：恩度誘導人肝癌細胞SMMC-7721 抑制性VEGFA選擇性剪切異構體VEGF165b的表達及意義
　　 目的：探討重組人血管內(nèi)皮抑素(rh

3、-Endostatin，Endostar，恩度)在人肝癌細胞SMMC-7721中對VEGF165b表達的影響，及上調(diào)VEGF165b表達后，SMMC-7721對恩度敏感性的變化。
　　 方法：采用RT-PCR法和Western Blot法，檢測恩度干預SMMC-7721 以后VEGF165b的表達變化；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染VEGF165b 真核表達質(zhì)粒到SMMC-7721，RT-PCR和免疫細胞熒光共聚焦顯微鏡檢測VEGF165b，HIF-

4、1α和下游靶基因VEGFA表達的變化；MTT法檢測轉(zhuǎn)染VEGF165b 真核表達質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒相比，恩度對人肝癌細胞生長的影響。
　　 結果：恩度誘導SMMC-7721的VEGF165b mRNA和蛋白表達上調(diào)，而VEGF165b可下調(diào)HIF-1α及下游靶基因VEGFA的表達。轉(zhuǎn)染VEGF165b 后，恩度引起SMMC-7721的生長抑制率進一步增加。
　　 結論：恩度抗腫瘤新生血管的作用部分是通過上調(diào)VEGF165b

5、 介導的，VEGF165b能增加SMMC-7721細胞對恩度的敏感性，兩者治療腫瘤有協(xié)同作用。
　　 第三部分：力比泰通過抑制Sp1 誘導人肝癌細胞VEGFA基因剪切異構體差異性表達
　　 目的：研究力比泰干預人肝癌細胞系HepG2 后Sp1和VEGFA基因的表達狀況。
　　 力比泰與VEGF165b 或恩度聯(lián)合后誘導SMMC-7721細胞生長抑制率的變化以及力比泰對裸鼠移植瘤生長的影響。
　　 方法：R

6、T-PCR，western blot，細胞免疫熒光檢測力比泰或betulinic acid 干預HepG2細胞后，Sp1和VEGFA基因表達的變化，MTT法檢測聯(lián)合VEGF165b 或恩度后，Alimta誘導SMMC-7721細胞生長抑制率的變化，及對裸鼠移植瘤模型的治療作用。
　　 結果：力比泰誘導HepG2的Sp1和VEGFA基因表達下調(diào)，并且誘導VEGFA基因的刺激性異構體表達減少和抑制性異構體表達增加。Sp1的特異性抑制