人剪切修復(fù)基因XPD對肝癌SMMC-7721細(xì)胞生長抑制的研究.pdf

1、目的:研究表明，野生人剪切修復(fù)基因著色性干皮病基因D（Xeroderma Pigmentosum D，XPD）在重要的DNA修復(fù)路徑--核苷酸切除修復(fù)中有關(guān)鍵作用，是DNA修復(fù)路徑中的重要因子。XPD發(fā)生基因突變時，腫瘤的易感性會增高。本課題主要研究野生型XPD基因?qū)Ω伟㏒MMC-7721細(xì)胞生長的影響，探討XPD基因抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞生長的機(jī)理。 方法用堿裂解法從制備好的大腸桿菌中提取空載質(zhì)粒pEGFP-N2及重組

2、質(zhì)粒pEGFP-N2-XPD，并用KPN1、BGIⅡ和SPHⅠ對提取出的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。實驗分三組，重組質(zhì)粒XPD-N2組、以空載質(zhì)粒N2，及用與XPD-N2、N2具有相同遺傳背景和代數(shù)的肝癌SMMC-7721細(xì)胞作為兩個空白對照組。用脂質(zhì)體分別瞬時轉(zhuǎn)染三組細(xì)胞。并在熒光顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)染后綠色熒光蛋白基因表達(dá)情況。使用流式細(xì)胞儀監(jiān)測細(xì)胞周期，統(tǒng)計細(xì)胞各周期的百分率。提取三組細(xì)胞總RNA，合成cDNA，用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測三組細(xì)

3、胞中p27、Cdk2及Cdk7表達(dá)情況，Western blot法檢測細(xì)胞中p27、Cdk2及Cdk7表達(dá)量變化，在96孔板中進(jìn)行MTT試驗以觀察細(xì)胞增殖的活力變化。 結(jié)果1、提取出的重組質(zhì)粒pEGFP-N2-XPD用酶切鑒定，進(jìn)行電泳色帶與Genebank中公布的人類XPD完整mRNA序列NM_000400分析預(yù)期相吻合。2、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后40h，在熒光顯微鏡下觀察到在SMMC-7721-pEGFP-N2，SMMC-7721-pE

4、GFP-N2-XPD兩組中有綠色熒光蛋白的表達(dá)。3、流式細(xì)胞儀監(jiān)測到與其它兩對照組相比，轉(zhuǎn)染了pEGFP-N2-XPD重組質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞數(shù)進(jìn)入S期明顯減少，停滯在G1期。4、應(yīng)用RT-PCR、Western blot檢測 SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD細(xì)胞與SMMC-7721-pEGFP-N2、SMMC-7721兩對照組顯示：其XPD表達(dá)明顯升高（P<0.05）。p27相對表達(dá)量升高（P<0.05），Cdk7相對表達(dá)量明顯