池蝶蚌親環(huán)蛋白D(CypD)基因的表達及對人肝癌細胞(SMMC-7721)生長的影響.pdf

1、本研究以淡水貝類池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)為研究對象，用HsCypD基因完整的ORF與pGEX-4T1構(gòu)建重組載體，將重組質(zhì)粒pGEX-4T1-HsCypD轉(zhuǎn)化E.coil BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，然后進行原核表達，后經(jīng)小量誘導以確定IPTG濃度及溫度等表達條件，成功表達出分子量約為67kDa的GST-HsCypD融合蛋白。利用GST親和層析獲得單一GST-HsCypD融合蛋白后，用凝血酶切除融合蛋白的G

2、ST標簽，再用GST親和層析去掉切下的GST標簽，從而獲得純度較高的分子量約為41kDa左右的HsCypD蛋白。采用Bradford法用于測定蛋白濃度及含量，將符合抗體制備濃度要求的HsCypD作為抗原來免疫長耳朵兔，制備多克隆抗體。利用ELISA間接法來檢測所得抗體的效價，結(jié)果效價高達1:1024000。Western blot檢測結(jié)果表明得到的多克隆抗體不僅能與作為免疫抗原的HsCypD有較好的特異性結(jié)合，對于從池蝶蚌中提取的腸、肝

3、以及性腺的組織蛋白，也同樣具有較強的特異性結(jié)合，說明本研究獲得的確實是針對HsCypD特異性結(jié)合的抗體，為后續(xù)關(guān)于HsCypD的生物功能的相關(guān)研究提供了實驗基礎(chǔ)。
　　此后本研究利用HsCypD的抗體，通過免疫熒光定位技術(shù)來探究HsCypD在池蝶蚌的肝胰腺細胞和雌性性腺細胞中的位置。結(jié)果表明，在這些組織細胞中，HsCypD在細胞質(zhì)上的熒光強度很明顯。為了進一步確定HsCypD在細胞中的顯微定位，本研究成功構(gòu)建pEGFP-C1-Hs

4、CypD真核載體，瞬時轉(zhuǎn)染于人肝癌細胞(SMMC-7721)，表達后經(jīng)過激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果證實HsCypD在細胞中主要存在于細胞質(zhì)中。本次蛋白定位同以前關(guān)于HsCypD的生物信息學相關(guān)分析的結(jié)論相一致，我們推測該蛋白主要在細胞質(zhì)中行使相關(guān)的功能。
　　為了檢測HsCypD對肝癌細胞(SMMC-7721)生長的影響，將構(gòu)建好的pcDNA3.1(+)-HsCypD以及pcDNA3.1(+)空載質(zhì)粒，瞬時轉(zhuǎn)染SMMC-7721細

5、胞。轉(zhuǎn)染24小時后，分別提取未經(jīng)處理的空白對照組，轉(zhuǎn)染空載的空載對照組，以及實驗組的細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為模版，對HsCypD、p53、Bax、Bcl2和Caspase-3基因的表達做實時熒光定量PCR檢測。結(jié)果表明，相對于空載對照組，HsCypD過表達組中促凋亡基因p53、Bax、Caspase-3均有下調(diào)，而抑制凋亡基因Bcl2有大幅度的上調(diào)。后用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染了30個小時的三組細胞的凋亡情況，結(jié)果表明實驗組相對于空

6、載對照組的凋亡率有明顯的降低，說明HsCypD的過表達能夠減弱pcDNA3.1(+)空載表達造成的細胞凋亡影響，具有一定的抑制細胞凋亡的功能。將pcDNA3.1(+)-HsCypD和pcDNA3.1(+)分別轉(zhuǎn)染SMMC-7721細胞24小時后，加入不同濃度梯度的阿霉素刺激8小時，利用Caspase-3分光光度法檢測試劑盒來檢測在不同條件下細胞的caspase-3活化程度。結(jié)果表明，HsCypD的過量表達能夠抑制阿霉素誘導的caspas