冷刺激活化的棕色脂肪對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化病變的影響和機(jī)制研究.pdf

1、論文Ⅰ短期冷刺激對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型機(jī)體代謝和血管病變的影響
　　 動(dòng)脈粥樣硬化(AS)相關(guān)的心血管疾病嚴(yán)重危害人類健康，已成為全球范圍的首要致死原因。盡管在AS預(yù)防和治療方面取得很大進(jìn)展，但仍有許多重大的科學(xué)問(wèn)題亟待解決。早在1938年，Bean WB.等報(bào)告冷環(huán)境與心肌梗死發(fā)生率增加具有相關(guān)性研究。經(jīng)過(guò)了幾個(gè)世紀(jì)的研究，越來(lái)越多的流行病學(xué)證據(jù)提示，心血管病事件的發(fā)生與寒冷的季節(jié)或冷環(huán)境有著密切的相關(guān)聯(lián)系。研究表明，氣溫與心

2、肌梗死和中風(fēng)的發(fā)生率有明顯的負(fù)相關(guān)性。最近一項(xiàng)臨床研究表明，冬季平均氣溫每降低1℃，心肌梗死的發(fā)生率將增加2.2％，再次證明冷環(huán)境可增加心血管病事件.然而，冷刺激或低溫誘發(fā)心血管病事件的具體機(jī)制一直未明。長(zhǎng)期以來(lái)，寒冷所致的血壓升高和血管痙攣被認(rèn)為是導(dǎo)致心血管事件的原因，但這些生理反應(yīng)均為一過(guò)性，既不能解釋溫度與事件之間的定量關(guān)系，也不能解釋寒冷環(huán)境下無(wú)血壓升高的血管痙攣發(fā)生的心血管事件的發(fā)生。
　　 近年研究發(fā)現(xiàn)，低密度脂蛋白

3、膽固醇水平作為心血管疾病重要的危險(xiǎn)因素，與冬季心血管病事件發(fā)生率增加這一季節(jié)性變化相一致。在2013年美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)ACC第62屆年度科學(xué)會(huì)議上，巴西坎皮納斯州立大學(xué)醫(yī)學(xué)博士Filipe AzevedoMoura等人報(bào)道了一項(xiàng)令人矚目的大樣本人群研究。他們?cè)?008-2010年間收集了22.7萬(wàn)名坎皮納斯居民的血液樣本，發(fā)現(xiàn)與夏季相比，受試者LDL-C＞130mg/dl的發(fā)生率在冬季平均增加8％;與冬季相比，夏季HDL-C＜40mg/d

4、l的發(fā)生率則會(huì)增加大約9％，TG＞150mg/dl的發(fā)生率約增加5％。證明，氣溫和人血脂水平之間具有明顯相關(guān)性，為深入研究冬季致心血管事件增高的機(jī)制提供新的思路。
　　 近年研究發(fā)現(xiàn)，脂肪的代謝與溫度存在密切關(guān)系，寒冷環(huán)境中，脂肪組織的代謝發(fā)生變化。脂肪組織是人體重要的代謝器官，主要由兩種功能不同的脂肪組織組成:白色脂肪組織和棕色脂肪組織。WAT是能量?jī)?chǔ)存、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝和分泌胰島素抵抗激素和細(xì)胞因子的主要部位;BAT的生理性作用

5、是產(chǎn)熱維持機(jī)體的溫度，主要負(fù)責(zé)分解白色脂肪，轉(zhuǎn)化為二氧化碳、水和熱量，是基礎(chǔ)性和誘導(dǎo)性能量輸出的主要部位。寒冷環(huán)境下激活的脂肪代謝產(chǎn)熱就是由棕色脂肪來(lái)完成。
　　 在嚙齒類動(dòng)物中，冷刺激可有效地活化棕色脂肪組織，也可有效地促進(jìn)白色脂肪組織向具有高代謝率的棕色脂肪樣組織(BAT-like tissue， BRITE)轉(zhuǎn)型。近期幾項(xiàng)研究表明，成年人體內(nèi)有大量的BAT，而且冷刺激可促進(jìn)BAT的活化?；谝陨衔墨I(xiàn)和研究，我們提出了以下假

6、說(shuō):1.冷刺激可顯著活化apoE-/-小鼠棕色脂肪組織，影響脂肪組織脂降解速率，改變小鼠的血脂水平和能量代謝;2冷刺激可促進(jìn)apoE-/-小鼠WAT轉(zhuǎn)變?yōu)锽RITE，影響脂肪組織脂降解速率，改變小鼠的血脂水平和能量代謝;3.冷刺激可影響B(tài)AT的活化和WAT/BRITE的轉(zhuǎn)換，改變血脂水平，從而影響apoE-/-小鼠AS的進(jìn)程。
　　 為了驗(yàn)證以上假說(shuō)，我們利用冷刺激模型(4℃)進(jìn)行研究和并選用等熱區(qū)內(nèi)環(huán)境(30℃)作為對(duì)照，選取

7、AS的經(jīng)典動(dòng)物模型apoE-/-小鼠以及同樣基因背景的C57野生型小鼠作為對(duì)照，并著重研究雄性小鼠的以下幾個(gè)脂肪組織儲(chǔ)點(diǎn):皮下白色脂肪組織(sWAT)、附睪白色脂肪組織(eWAT)和肩胛間區(qū)棕色脂肪組織(iBAT)。將8周齡apoE-/-雄性小鼠隨機(jī)分為30℃組和4℃組，觀察冷刺激后，BAT的活化以及WAT向BRITE的轉(zhuǎn)化對(duì)小鼠AS進(jìn)展和斑塊穩(wěn)定性的影響。
　　 目的：
　　 1.研究冷刺激是否能有效活化BAT2.研究

8、冷刺激是否能促進(jìn)WAT向BRITE轉(zhuǎn)化3.研究冷刺激是否促進(jìn)AS的進(jìn)程方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:8周齡雄性C57BL/6小鼠和apoE-/-小鼠購(gòu)自北京維通利華公司，所有動(dòng)物在取材時(shí)，均使用0.8％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后脫臼處死。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會(huì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求和規(guī)定。
　　 2.冷刺激模型構(gòu)建:apoE-/-和C57BL/6野生型小鼠，隨機(jī)分組，先將冷刺激組小鼠放入18℃中冷適應(yīng)一周后，

9、再轉(zhuǎn)移至4℃中飼養(yǎng);將30℃組小鼠直接放置在30℃中飼養(yǎng)。
　　 3.代謝率檢測(cè):在冷刺激結(jié)束時(shí)，將小鼠麻醉后置于小動(dòng)物呼吸代謝測(cè)量?jī)x的呼吸室中，連續(xù)記錄30min的O2消耗量，CO2呼出量以及溫度，濕度和壓力，作為小鼠的基礎(chǔ)代謝率。皮下注射NE，繼續(xù)連續(xù)記錄90min的呼吸代謝參數(shù)，作為小鼠活體狀態(tài)下BAT活性的檢測(cè)指標(biāo)。
　　 4.脂降解速率檢測(cè):冷刺激結(jié)束后，將apoE-/-小鼠麻醉，分離eWAT組織，一部分組織用

10、于制備組織勻漿，檢測(cè)脂肪組織中cAMP水平;另一部分脂肪組織，消化分離脂肪細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞脂降解產(chǎn)物甘油的水平。
　　 5.組織樣本采集:各組小鼠禁食過(guò)夜，麻醉后從心尖抽取血液。處死小鼠后，分別收集各儲(chǔ)點(diǎn)的脂肪組織，心臟血管組織。用于檢測(cè)基因mRNA水平等的分子生物學(xué)研究的樣本，分離組織后迅速置于液氮中保存?zhèn)溆?。用于組化研究的組織則置于4％甲醛中固定過(guò)夜后，用1 XPBS洗滌，一部分組織用于石蠟包埋，一部分用于制備冰凍切片。

11、>　　 6.血脂水平檢測(cè):小鼠麻醉后，留取血液分離血漿，并檢測(cè)血漿中TC、TG、LDL-C、HDL-C、FFA和皮質(zhì)醇水平。
　　 7.組織學(xué)染色以及免疫組織化學(xué)染色:脂肪組織和血管組織均進(jìn)行HE染色。對(duì)血管組織還進(jìn)行天狼猩紅染色來(lái)評(píng)估膠原含量，進(jìn)行油紅O染色反映斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量。并對(duì)各組織切片進(jìn)行相應(yīng)的免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)各指標(biāo)的蛋白表達(dá)情況。
　　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，應(yīng)用雙側(cè)t檢驗(yàn)。設(shè)P＜

12、0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.冷刺激活化BAT并誘導(dǎo)BRITEsWAT和eWAT的組織學(xué)分析顯示冷刺激組小鼠的脂肪細(xì)胞形態(tài)更小，sWAT和eWAT總體積也小。HE染色顯示，4℃組小鼠的sWAT和eWAT具有更致密和豐富的細(xì)胞器。免疫組織化學(xué)染色顯示4℃組sWAT和eWAT中UCP1高表達(dá)，而在30℃組幾乎檢測(cè)不到。這些證據(jù)提示，冷刺激可促進(jìn)apoE-/-小鼠的WAT向BRITE轉(zhuǎn)化。冷刺激顯著增加iB

13、AT中的UCP1的表達(dá)，顯著增加apoE-/-小鼠NST能力，證實(shí)冷刺激可迅速活化小鼠BAT。免疫組化染色和脂肪組織整體包埋染色均顯示冷刺激可顯著增加4℃組的WAT和BAT中的微血管密度。
　　 2.冷刺激促進(jìn)脂降解和代謝冷刺激顯著減輕的apoE-/-和野生型小鼠的體重和體重指數(shù)，證實(shí)冷刺激增加了機(jī)體的代謝率，使小鼠呈現(xiàn)苗條的形態(tài)。冷刺激顯著增加apoE-/-小鼠的代謝率。血漿甘油三酯水平顯著降低，而總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇

14、水平以及甘油水平顯著增加，游離脂肪酸的水平基本無(wú)差別。
　　 3.脂降解相關(guān)的基因表達(dá)增加為了研究代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平變化，我們選取有顯著B(niǎo)RITE改變的inWAT，進(jìn)行全基因組芯片分析?；虼睾椭饕煞址治霰砻骰虮磉_(dá)模式具有極高的可重復(fù)性。4℃組inWAT的許多脂降解相關(guān)基因(UCP1，Cidea，Pdk4，Acadv1，Cox8b，Cox7a1，Thea，F(xiàn)abp3，Acaa2，S(l)c25a20，E(l)ov(l)3

15、等)的表達(dá)水平顯著增加。而且，其中許多高表達(dá)的脂降解相關(guān)的基因(HSL，F(xiàn)AS，GK)都是脂質(zhì)氧化分解相關(guān)的重要的酶。實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)一步證實(shí)了這些基因的高mRNA水平。
　　 與30℃組相比，冷刺激組eWAT的cAMP水平顯著增加。另外，將30℃和4℃小鼠eWAT分離的脂肪細(xì)胞，加入或不加ISO進(jìn)行培養(yǎng)，4℃組小鼠的脂肪細(xì)胞在ISO作用下，迅速增加了脂降解產(chǎn)物甘油的釋放速率，證實(shí)4℃組小鼠的脂肪細(xì)胞具有更高的脂降解速率。

16、>　　 4.冷刺激促進(jìn)apoE-/-小鼠斑塊的生長(zhǎng)大體油紅O染色顯示冷刺激組小鼠的主動(dòng)脈弓，胸主動(dòng)脈，腹主動(dòng)脈和髂總動(dòng)脈均有更廣泛的斑塊。橫截面切片分析也證實(shí)，冷刺激組小鼠主動(dòng)脈根部的斑塊顯著高于30℃對(duì)照組。油紅O染色也進(jìn)一步證實(shí)冷刺激顯著促進(jìn)AS斑塊的增長(zhǎng)。
　　 結(jié)論：
　　 1.冷刺激可顯著活化apoE-/-小鼠BAT，引起WAT向BRITE的轉(zhuǎn)化。
　　 2.冷刺激引起的脂肪組織變化，可顯著促進(jìn)脂降解

17、速率，增加血漿LDL-C水平。
　　 3.冷刺激可顯著加重apoE-/-小鼠AS的病變。
　　 論文Ⅱ長(zhǎng)期冷刺激對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型機(jī)體代謝與斑塊穩(wěn)定性的響應(yīng)和機(jī)制研究
　　 根據(jù)WHO最新發(fā)布的衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)公告，由AS所導(dǎo)致的急性心肌梗死、心絞痛、心臟性猝死、缺血性腦卒中、心力衰竭等心血管疾病已成為全世界第一位死因，年死亡人數(shù)近2000萬(wàn)，占各種疾病死因的22％。據(jù)預(yù)測(cè)，至2030年，心血管疾病仍將是全球的首位死

18、因，占全因死亡率的26％。我國(guó)平均每11.6秒即有1人死于心血管疾病，心血管疾病已成為中國(guó)的第一位殺手，這一死亡速度是美國(guó)的3倍。因此，解決重大問(wèn)題深入研究AS的發(fā)生機(jī)制治療靶點(diǎn)已成為急需。AS的主要危害在于AS所導(dǎo)致的急性心血管事件。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，急性心血管事件的發(fā)生是由于AS斑塊逐漸增大突入管腔，造成管腔狹窄和組織缺血。然而近年研究發(fā)現(xiàn)，斑塊破裂和糜爛所誘發(fā)的血栓形成是急性心血管事件發(fā)生的主要機(jī)制，因而這類斑塊被稱為不穩(wěn)定斑塊。穩(wěn)定

19、型心絞痛的AS斑塊是:有較厚的纖維帽、內(nèi)含大量的細(xì)胞外基質(zhì)、較少的脂質(zhì)和巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞，屬于較穩(wěn)定的斑塊。
　　 血管壁中膽固醇的沉積貫穿AS的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，在AS斑塊的破裂中也充當(dāng)了重要角色，LDL-C可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞凋亡，激活基質(zhì)金屬蛋白酶，削弱纖維帽，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)，最終引發(fā)斑塊破裂和血栓形成。AS的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)慢性炎癥的過(guò)程。AS斑塊中的慢性炎癥轉(zhuǎn)變?yōu)榧毙匝装Y是斑塊發(fā)生破裂的關(guān)鍵因素。大量研究證實(shí)

20、，斑塊內(nèi)出血顯著加劇AS斑塊不穩(wěn)定性，斑塊內(nèi)出血主要來(lái)源于斑塊內(nèi)不成熟的新生滋養(yǎng)血管。
　　 為了排除冷刺激對(duì)AS的影響僅存在于apoE-/-小鼠這一特殊模型，我們選擇了另一經(jīng)典AS小鼠模型LDLR-/-小鼠，進(jìn)一步研究冷刺激對(duì)AS的影響和作用機(jī)制。結(jié)合以上文獻(xiàn)和前期研究，我們提出如下假說(shuō):1.冷刺激能夠明顯加劇BAT活化和促進(jìn)WAT/BRITE轉(zhuǎn)化，增加脂肪組織的脂降解速率和肝臟膽固醇合成速率，影響血脂的代謝平衡，促進(jìn)AS的進(jìn)

21、展和AS斑塊的易損性;2.冷刺激顯著增加apoE-/-小鼠外周循環(huán)和斑塊局部的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)斑塊內(nèi)血管新生，從而顯著增加AS斑塊的不穩(wěn)定性;3.冷刺激顯著促進(jìn)了LDLR-/-小鼠的AS進(jìn)程并加重了斑塊易損性?；谝陨霞僬f(shuō)，我們選取apoE-/-小鼠和LDLR-/-小鼠，進(jìn)一步探討了冷刺激對(duì)AS病變的影響及其具體機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:8周齡雄性apoE-/-小鼠購(gòu)自北京維通利華公司，8周齡雄性LDLR-

22、/-小鼠購(gòu)自南京動(dòng)物模型研究所，所有動(dòng)物在取材時(shí)，均使用0.8％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后脫臼處死。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會(huì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求和規(guī)定。
　　 2.冷刺激模型構(gòu)建:apoE-/-和LDLR-/-小鼠，隨機(jī)分組，將冷刺激組小鼠先放入18℃中適應(yīng)一周后，轉(zhuǎn)移至4℃中飼養(yǎng);而30℃組小鼠則直接放置在30℃中飼養(yǎng)。
　　 3.代謝率檢測(cè):在冷刺激結(jié)束前，將小鼠麻醉后置于小動(dòng)物呼吸代謝測(cè)量?jī)x的呼吸室中

23、，連續(xù)記錄30min的O2消耗量，CO2呼出量以及溫度，濕度和壓力，作為小鼠的基礎(chǔ)代謝率。皮下注射NE，繼續(xù)連續(xù)記錄90min的呼吸代謝參數(shù)，作為小鼠活體狀態(tài)下BAT活性的檢測(cè)指標(biāo)。
　　 4.脂降解速率檢測(cè):冷刺激結(jié)束后，將apoE-/-小鼠麻醉，分離eWAT組織，一部分組織用于制備組織勻漿，檢測(cè)脂肪組織中cAMP水平;另一部分脂肪組織，消化分離脂肪細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞脂降解產(chǎn)物甘油的水平。
　　 5.組織樣本采集:各組小鼠

24、禁食過(guò)夜，麻醉后從心尖抽取血液。處死小鼠后，分別收集各儲(chǔ)點(diǎn)的脂肪組織，心臟血管組織。用于檢測(cè)基因mRNA水平等的分子生物學(xué)研究的樣本，分離組織后迅速置于液氮中保存?zhèn)溆?。用于組化研究的組織則置于4％甲醛中固定過(guò)夜后，用1（X） PBS洗滌，一部分組織用石蠟包埋，一部分用于制備冰凍切片。
　　 6.FPLC檢測(cè):快速蛋白液相質(zhì)譜分析法被用于詳細(xì)分析血漿中膽固醇和TG的具體脂蛋白成分。吸取100ul血漿樣本，使用Superose6 H

25、R10/30分離柱，用無(wú)菌（1）xPBS（0.02％ sodium azide，pH7.4.）進(jìn)行洗脫。以0.5ml/min的速度進(jìn)行洗脫，收集60個(gè)fraction樣本，0.5ml/fraction。使用ELISA檢測(cè)法，檢測(cè)每fraction中膽固醇和TG的含量。其中5-10分升被用于計(jì)算VLDL/IDL，11-19用于分析LDL，而20-30分升被用于分析HDL。
　　 7.肝臟膽固醇合成速率:在冷刺激八周末，分別隨機(jī)選取

26、6只小鼠，腹腔注射20μCi[3H]標(biāo)記的水。1小時(shí)后，[3H]標(biāo)記的水與小鼠體內(nèi)的水達(dá)到平衡狀態(tài)。麻醉后，留取小鼠的全血，分離獲得血漿。用生理鹽水灌注小鼠循環(huán)系統(tǒng)，分離肝臟組織。分別從每只小鼠取約200-300mg左右的肝臟組織，將肝臟組織勻漿后，皂化，分離出洋地黃皂甙可沉淀的甾醇。檢測(cè)每小時(shí)每g組織中，有多少[3H]標(biāo)記的水摻入到洋地黃皂甙可沉淀的甾醇。
　　 8.組織學(xué)染色以及免疫組織化學(xué)染色:脂肪組織和血管組織均根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)

27、的HE染色步驟進(jìn)行染色。對(duì)血管組織還進(jìn)行天狼猩紅染色來(lái)評(píng)估膠原含量，進(jìn)行油紅O染色反映斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量。并對(duì)各組織切片進(jìn)行相應(yīng)的免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)各指標(biāo)的蛋白表達(dá)情況，使用各種一抗，檢測(cè)主動(dòng)脈根部斑塊的脂質(zhì)，巨噬細(xì)胞，平滑肌，以及I型膠原含量，計(jì)算斑塊的易損指數(shù)。易損指數(shù)的計(jì)算公式:（脂質(zhì)+巨噬細(xì)胞）/（平滑肌+Ⅰ型膠原）。
　　 9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，應(yīng)用雙側(cè)t檢驗(yàn)。設(shè)P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

28、>　　 結(jié)果：
　　 1.冷刺激活化BAT并誘導(dǎo)BRITEsWAT和eWAT的組織學(xué)分析顯示冷刺激組小鼠的脂肪細(xì)胞形態(tài)更小，sWAT和eWAT總體積也小。HE染色顯示，4℃組小鼠的sWAT和eWAT具有更致密和豐富的細(xì)胞器。免疫組織化學(xué)染色顯示4℃組sWAT和eWAT中UCP1高表達(dá)，而在30℃組幾乎檢測(cè)不到。這些證據(jù)提示，冷刺激下apoE-/-小鼠的WAT可轉(zhuǎn)變?yōu)锽RITE。冷刺激也顯著增加了肩胛間區(qū)BAT中的UCP1的表達(dá)

29、。冷刺激也可顯著增加4℃組的WAT和BAT中的微血管密度。
　　 2.冷刺激促進(jìn)脂降解和代謝冷刺激顯著減輕的apoE-/-和野生型小鼠的體重和體重指數(shù)，證實(shí)冷刺激增加了機(jī)體的代謝率，使小鼠呈現(xiàn)苗條的形態(tài)。冷刺激顯著增加apoE-/-小鼠的代謝率。血漿TG水平顯著降低，而TC和LDL-C水平以及甘油水平顯著增加，游離脂肪酸的水平基本無(wú)差別。
　　 3.脂降解相關(guān)的基因表達(dá)增加為了研究代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平變化，我們選取有顯

30、著B(niǎo)RITE改變的inWAT，進(jìn)行全基因組芯片分析?；虼睾椭饕煞址治霰砻骰虮磉_(dá)模式具有極高的可重復(fù)性。4℃組inWAT的許多脂降解相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著增加。而且，其中許多高表達(dá)的脂降解相關(guān)的基因都是脂質(zhì)氧化分解相關(guān)的重要的酶。實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)一步證實(shí)了這些基因的高mRNA水平。
　　 冷刺激組的eWAT與30℃組相比，具有顯著增加的cAMP水平。另外，將30℃和4℃小鼠eWAT分離的脂肪細(xì)胞，加入或不加ISO進(jìn)行培養(yǎng)。4

31、℃組小鼠的脂肪細(xì)胞在ISO作用下，迅速增加了脂降解產(chǎn)物甘油的釋放速率，證實(shí)4℃組小鼠的脂肪細(xì)胞具有更高的脂降解速率。
　　 4.冷刺激明顯改變血脂成分FPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，冷刺激組小鼠的血漿膽固醇以VLDL增加為主，IDL和LDL也顯著增加。血漿HDL膽固醇含量則基本與30℃組小鼠無(wú)很大差別。我們利用腹腔注射[3H]-標(biāo)記的水，進(jìn)行檢測(cè)小鼠肝臟膽固醇合成速率，發(fā)現(xiàn)冷刺激下的apoE-/-小鼠具有顯著升高的膽固醇合成速率。我們還發(fā)現(xiàn)肝

32、臟組織中膽固醇合成相關(guān)的幾個(gè)重要基因的mRNA水平也在冷刺激下發(fā)生了顯著增加。其中，HMG-CoA還原酶，SREBPs等多個(gè)膽固醇合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子以及其結(jié)合蛋白SCAP等都顯著增加。而血漿TG在冷刺激下顯著降低。
　　 5.冷刺激促進(jìn)apoE-/-小鼠斑塊的增長(zhǎng)大體油紅O染色顯示，長(zhǎng)期冷刺激組的apoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部斑塊與短期冷刺激組相比，斑塊面積顯著增加，而30℃環(huán)境中，長(zhǎng)期和短期相比僅有較小的增長(zhǎng)趨勢(shì)。橫截面組織切片

33、的HE染色顯示，長(zhǎng)期冷刺激組小鼠的斑塊面積顯著增長(zhǎng)，而30℃小鼠在經(jīng)過(guò)不同的暴露時(shí)間是，其變化不是很明顯。
　　 6.冷刺激加劇apoE-/-小鼠斑塊的易損性免疫組織化學(xué)染色顯示，冷刺激8周后，小鼠主動(dòng)脈斑塊的平滑肌和I型膠原含量顯著減少，巨噬細(xì)胞和脂質(zhì)的含量顯著增高，顯著增加apoE-/-小鼠AS斑塊的易損指數(shù)。組織化學(xué)分析還顯示，冷刺激組織小鼠的主動(dòng)脈斑塊有更大的壞死核心和更薄的纖維帽。這兩個(gè)參數(shù)進(jìn)一步證實(shí)，冷刺激組的apo

34、E-/-小鼠主動(dòng)脈根部斑塊具有更高的不穩(wěn)定性，更加易于破裂，危險(xiǎn)性更高。
　　 7.冷刺激促進(jìn)LDLR-/-小鼠斑塊的增長(zhǎng)和易損性與apoE-/-類似，冷刺激8周后，WAT的UCP1表達(dá)顯著增加，向BRITE轉(zhuǎn)變;LDLR-/-小鼠BAT的UCP1表達(dá)量也顯著增加。同時(shí)，在匹配飲食量喂養(yǎng)的條件下，冷刺激也能顯著減低LDLR-/-小鼠的體重和體重指數(shù)。表明，脂降解在冷刺激組的LDLR-/-小鼠中也得到了顯著增加。而NST相關(guān)的代謝

35、率檢測(cè)則進(jìn)一步證實(shí)在冷刺激下的LDLR-/-小鼠中具有更高的代謝狀態(tài)。
　　 冷刺激顯著增加了脂降解相關(guān)的重要的成分cAMP的水平。而同樣地，冷刺激組LDLR-/-小鼠脂肪細(xì)胞的脂降解產(chǎn)物甘油水平也顯著高于30℃對(duì)照組，進(jìn)一步提示，冷刺激使其脂降解速率顯著增加。4℃組小鼠具有較高的血漿TC水平和LDL-C水平。FPLC的進(jìn)一步分析顯示4℃組小鼠具有較高的VLDL-C和LDL-C水平，HDL-C水平則在兩組間無(wú)顯著差異。
　

36、　 與apoE-/-小鼠相比，LDLR-/-小鼠的斑塊發(fā)展沒(méi)有那么的迅猛。但組織學(xué)檢測(cè)仍然發(fā)現(xiàn)，冷刺激顯著增加LDLR-/-小鼠的斑塊面積，斑塊易損性相關(guān)指標(biāo)包括巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，脂質(zhì)沉積都顯著高于30℃LDLR-/-小鼠，平滑肌和Ⅰ型膠原含量則顯著降低。冷刺激下的LDLR-/-小鼠的易損指數(shù)比30℃組高出約8倍多。與apoE-/-小鼠類似，冷刺激組的斑塊也具有更大的壞死核心和薄的纖維帽。綜上所述，冷刺激可顯著促進(jìn)LDLR-/-小鼠的AS

37、斑塊的發(fā)展和易損性，而且這一現(xiàn)象并不只局限于某一特類小鼠中。
　　 結(jié)論：
　　 1.冷刺激顯著增加apoE-/-小鼠肝臟的膽固醇合成速率，增加血漿VLDL-C和LDL-C水平。
　　 2.冷刺激顯著增加apoE-/-小鼠循環(huán)系統(tǒng)和斑塊局部的炎癥反應(yīng)，增加AS斑塊內(nèi)新生血管，從而顯著促進(jìn)AS斑塊的不穩(wěn)定性。
　　 3.冷刺激顯著促進(jìn)LDLR-/-小鼠的AS進(jìn)程，加劇AS斑塊的易損性。
　　 論文Ⅲ

38、冷刺激影響動(dòng)脈粥樣硬化病變的機(jī)制研究
　　 大量研究表明，冬季心血管疾病的死亡率顯著增加。但冬季與高發(fā)的心血管疾病尤其是冠心病間相關(guān)性的機(jī)制仍存在爭(zhēng)議，研究者們多認(rèn)為冷環(huán)境和/或呼吸道感染或冬季的間接影響如鏟雪等導(dǎo)致這些疾病的高發(fā)。但冷刺激具體是通過(guò)何種機(jī)制影響心血管疾病進(jìn)程，至今尚無(wú)公認(rèn)觀點(diǎn)。我們?cè)谇捌谘芯恐幸羊?yàn)證，冷刺激可顯著加劇小鼠的AS進(jìn)程，增加斑塊的不穩(wěn)定性，同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，冷刺激也顯著增加了小鼠血漿LDL-C。冷刺激

39、是通過(guò)活化交感神經(jīng)系統(tǒng)-NE-BAT/BRITE-UCP1-脂降解事件鏈而發(fā)揮了以上的影響。為了進(jìn)一步證實(shí)以上作用通路具體環(huán)節(jié)，在本研究中我們分別在NE和UCP1這兩個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)展開(kāi)了相關(guān)研究。
　　 眾所周知，冷刺激迅速興奮交感神經(jīng)系統(tǒng)，釋放大量NE。為了闡明NE的生理作用在多大程度上通過(guò)β3-腎上腺素能受體介導(dǎo)完成，學(xué)者們常對(duì)比研究NE刺激和某些β3-腎上腺素能受體特異性激動(dòng)劑的差異。其中CL-316243為現(xiàn)有的最為特異性β

40、3-腎上腺素能受體激動(dòng)劑。相反地，想要去除β3-腎上腺素能受體的活化作用，常使用β3-腎上腺素能受體拮抗劑(SR59230A)。結(jié)合前期研究我們推測(cè)，冷刺激對(duì)apoE-/-小鼠AS的影響是因?yàn)镹E激活β3-腎上腺素能受體，活化BAT并引發(fā)WAT向BRITE的轉(zhuǎn)換，脂降解增加，脂質(zhì)代謝改變，引發(fā)膽固醇合成增加外，高血漿膽固醇水平而促進(jìn)AS的進(jìn)程。
　　 脂肪因子尤其是脂聯(lián)素與AS的關(guān)系備受關(guān)注。脂聯(lián)素轉(zhuǎn)基因小鼠證實(shí)脂聯(lián)素可改善胰島

41、素抵抗和糖尿病，而脂聯(lián)素敲除小鼠則表現(xiàn)出中度胰島素抵抗以及血糖不耐受，同時(shí)也體現(xiàn)了代謝綜合征的其他的一些特征，包括血脂異常和高血壓。研究證明，低脂聯(lián)素血漿水平與人類胰島素抵抗相關(guān)的許多狀態(tài)密切相關(guān)，如血脂異常，心血管疾病以及高血壓。鑒于脂肪組織和脂聯(lián)素以及脂聯(lián)素和AS間的密切關(guān)系，我們推測(cè)冷刺激明顯改變脂肪組織的代謝狀態(tài)，可影響血漿脂聯(lián)素水平，外源性注射脂聯(lián)素，亦可反向影響冷刺激條件下脂肪組織的代謝。
　　 在分泌脂肪因子和調(diào)節(jié)

42、機(jī)體代謝方面，BAT與WAT有著類似的功能。但與WAT不同的是，BAT的生理性作用是產(chǎn)熱維持機(jī)體的溫度。棕色脂肪細(xì)胞通過(guò)其大量的線粒體成分，利用UCP-1解偶聯(lián)細(xì)胞呼吸鏈而產(chǎn)熱起到保溫的作用。據(jù)此，我們提出以下科學(xué)假說(shuō):冷刺激活化的交感神經(jīng)系統(tǒng)，釋放的神經(jīng)遞質(zhì)NE，主要作用于β3-腎上腺素能受體，發(fā)揮其對(duì)BAT和WAT/BRITE的作用，從而改變UCP1表達(dá)，進(jìn)而影響脂降解速率以及血脂水平和AS進(jìn)程等。
　　 為了明確β3-腎上

43、腺素能受體在此過(guò)程中發(fā)揮的作用，我們?cè)诒疚闹羞x取了β3-腎上腺素能受體激動(dòng)劑（CL-316243）和β3-腎上腺素能受體拮抗劑(SR59230A)，研究了冷刺激對(duì)apoE-/-小鼠棕色脂肪組織和AS病變影響。為了進(jìn)一步探討UCP1是否是冷刺激影響AS發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，我們?cè)诒狙芯恐袠?gòu)建apoE-/-UCP1-/-雙基因敲除小鼠。隨機(jī)將8周齡apoE-/-UCP1-/-雄性小鼠分為30℃組和4℃組，探討UCP1敲除后，冷刺激是否仍會(huì)引

44、起脂肪組織的代謝改變，并加劇AS的進(jìn)程和易損性，進(jìn)一步揭示冷刺激影響AS的具體機(jī)制。
　　 目的：
　　 1.研究CL316243是否能對(duì)apoE-/-小鼠產(chǎn)生于冷刺激類似的影響。
　　 2.研究SR59230A是否能阻斷冷刺激對(duì)apoE-/-小鼠AS的影響。
　　 3.研究冷刺激對(duì)脂聯(lián)素水平影響，以及脂聯(lián)素與UCP1的關(guān)聯(lián)。
　　 4.研究UCP1在冷刺激加劇AS進(jìn)程中的作用。
　　 方

45、法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:
　　 8周齡雄性apoE-/-小鼠購(gòu)自北京維通利華公司，將apoE-/-小鼠和UCP1-/-小鼠雜交，構(gòu)建apoE-/-UCP-1-/-小、鼠。所有動(dòng)物在取材時(shí)，均使用0.8％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后脫臼處死。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會(huì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求和規(guī)定。
　　 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:
　　 8周齡雄性apoE-/-小鼠，高脂喂養(yǎng)四周后隨機(jī)分組:鹽水對(duì)照組和β

46、3-腎上腺素能受體激動(dòng)劑(CL316，243)組，仍放于22℃中正常飲食喂養(yǎng)四周后取材;
　　 8周齡雄性apoE-/-小鼠，高脂喂養(yǎng)四周后隨機(jī)分組:鹽水對(duì)照組和β3-腎上腺素能受體拮抗劑(SR59230A)，同時(shí)改為正常飲食，先放入18℃中適應(yīng)一周后，轉(zhuǎn)移至4℃中飼養(yǎng)三周。
　　 apoE-/-和AUDK小鼠，隨機(jī)分組，冷刺激組小鼠先放入18℃中適應(yīng)一周后，轉(zhuǎn)移至4℃中飼養(yǎng);而30℃組小鼠則直接放置在30℃中飼養(yǎng)。

47、r>　　 脂聯(lián)素實(shí)驗(yàn)組的apoE-/-小鼠，隨機(jī)分為30℃對(duì)照組，4℃空白對(duì)照組（4℃-VT）和4℃脂聯(lián)素治療組(4℃-Adipo)。
　　 3.代謝率檢測(cè):在冷刺激結(jié)束前，將小鼠麻醉后至于小動(dòng)物呼吸代謝測(cè)量?jī)x的呼吸室中，連續(xù)記錄30min的O2消耗量，CO2呼出量以及溫度，濕度和壓力，作為小鼠的基礎(chǔ)代謝率。皮下注射NE，繼續(xù)連續(xù)記錄90min的呼吸代謝參數(shù)，作為小鼠活體狀態(tài)下BAT活性的檢測(cè)指標(biāo)。
　　 4.組織樣本

48、采集:各組小鼠禁食過(guò)夜，麻醉后從心尖抽取血液。處死小鼠后，分別收集各儲(chǔ)點(diǎn)的脂肪組織，心臟血管組織。用于檢測(cè)基因mRNA水平等的分子生物學(xué)研究的樣本，分離組織后迅速置于液氮中保存?zhèn)溆谩Ｓ糜诮M化研究的組織則置于4％甲醛中固定過(guò)夜后，用1(X) PBS洗滌，一部分組織用石蠟包埋，一部分用于制備冰凍切片。
　　 5.組織學(xué)染色以及免疫組織化學(xué)染色:脂肪組織和血管組織均根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的HE染色步驟進(jìn)行染色。對(duì)血管組織還進(jìn)行天狼猩紅染色來(lái)評(píng)估膠原

49、含量，進(jìn)行油紅O染色反映斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量。并對(duì)各組織切片進(jìn)行相應(yīng)的免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)各指標(biāo)的蛋白表達(dá)情況，使用各種一抗，檢測(cè)主動(dòng)脈根部斑塊的脂質(zhì)，巨噬細(xì)胞，平滑肌，以及I型膠原含量，計(jì)算斑塊的易損指數(shù)。易損指數(shù)的計(jì)算公式:（脂質(zhì)+巨噬細(xì)胞）/（平滑肌+Ⅰ型膠原）。
　　 6.分子生物學(xué)檢測(cè):將脂肪組織一部分用于提取蛋白組織，進(jìn)行western-blotting檢測(cè)小鼠脂肪組織中UCP1的蛋白表達(dá)水平;另一部分脂肪組織用于提取R

50、NA，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)小鼠脂肪組織中UCP1的mRNA表達(dá)水平。
　　 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，應(yīng)用雙側(cè)t檢驗(yàn)。設(shè)P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.β3-腎上腺素能受體激動(dòng)劑(CL316，243)對(duì)apoE-/-小鼠的影響與冷刺激的作用相似，β3-腎上腺素能受體激動(dòng)劑顯著減低了常溫條件下apoE-/-小鼠的體重和體重指數(shù)，增加了小鼠的氧耗量即小鼠的NST能力。組織學(xué)病理

51、分析表明，CL316，243顯著減小了脂肪細(xì)胞大小，增加了UCP1的表達(dá)量，增加了脂肪組織的新生血管量，即活化了BAT，并促進(jìn)了WAT向BRITE的轉(zhuǎn)換。RT-PCR檢測(cè)同樣提示，β3-腎上腺素能受體激動(dòng)劑的作用類似于冷刺激的直接影響，CL316243可顯著增加脂肪組織中UCP1等基因的mRNA表達(dá)水平。
　　 β3-腎上腺素能受體激動(dòng)劑對(duì)apoE-/-的AS進(jìn)程同樣具有類似于冷刺激直接作用的影響，CL316243組小鼠的血漿總

52、膽固醇水平、LDL-C、HDL-C顯著高于鹽水對(duì)照組。大體油紅O染色顯示，CL316243顯著增加了apoE-/-小鼠血管組織的表面斑塊面積，主動(dòng)脈根部橫截面組織切片染色則進(jìn)一步提示，CL316243可顯著促進(jìn)小鼠AS斑塊的進(jìn)展，加劇小鼠斑塊的不穩(wěn)定性。斑塊組織的RT-PCR也提示，CL316243可顯著增加斑塊組織的炎性因子表達(dá)水平。
　　 2.β3-腎上腺素能受體拮抗劑(SR59230A)對(duì)apoE-/-小鼠的影響將β3-腎

53、上腺素能受體拮抗后，SR59230A并未影響冷刺激下小鼠體重和體重指數(shù)的改變，但其顯著抑制了冷刺激對(duì)小鼠血漿總膽固醇和LDL-C水平的增加作用，但仍高于30℃組。組織病理學(xué)染色則提示，β3-腎上腺素能受體拮抗劑顯著抑制了冷刺激對(duì)apoE-/-小鼠AS斑塊的促進(jìn)作用，且穩(wěn)定了冷刺激中的小鼠斑塊，增加了斑塊的纖維帽厚度，從而抑制了冷刺激對(duì)AS進(jìn)程的惡化作用。
　　 3.冷刺激對(duì)apoE-/-UCP1-/-(AUDK)小鼠的影響4℃組

54、AUDK小鼠體重和體重指數(shù)與30℃組AUDK小鼠無(wú)明顯的差異;4℃組AUDK小鼠的氧耗量和CO2呼出量與30℃組AUDK小鼠無(wú)明顯的差異;脂肪組織免疫組織化學(xué)染色驗(yàn)證AUDK小鼠中UCP1被完全敲除，iBAT和eWAT中均未見(jiàn)UCP1陽(yáng)性著色;脂肪組織的脂降解速率指標(biāo)cAMP和glycerol水平在AUDK小鼠的兩組間無(wú)明顯的差異。
　　 4℃組AUDK小鼠血漿總膽固醇水平明顯低于4℃-apoE-/-小鼠，與30℃AUDK小鼠間

55、無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;4℃組AUDK小鼠血漿低密度脂蛋白膽固醇水平則顯著低于4度apoE-/-小鼠，30℃組AUDK小鼠;4℃組AUDK小鼠血漿甘油三酯水平高于4℃組apoE-/-小鼠，而與30℃小鼠間無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 4℃組AUDK小鼠主動(dòng)脈根部斑塊面積明顯小于4℃組apoE-/-小鼠，略高于30℃組AUDK小鼠;4℃組AUDK小鼠斑塊內(nèi)脂質(zhì)和巨噬細(xì)胞含量明顯低于30℃組AUDK小鼠;4℃組AUDK小鼠斑塊內(nèi)平滑肌含量

56、明顯低于30℃AUDK小鼠;4℃組AUDK小鼠斑塊內(nèi)I型膠原含量明顯高于30℃AUDK小鼠;4℃組AUDK小鼠斑塊的易損指數(shù)與30℃組AUDK小鼠無(wú)明顯差異，卻明顯低于4℃組apoE-/-小鼠。
　　 4.冷刺激對(duì)apoE-/-小鼠血漿脂聯(lián)素水平的影響冷刺激4周明顯降低了apoE-/-小鼠血漿脂聯(lián)素的水平，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;冷刺激8周的apoE-/-小鼠血漿脂聯(lián)素水平持續(xù)低于30℃對(duì)照組apoE-/-小鼠，雖然差異不像短期刺

57、激組那么明顯，但仍具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;全程正常喂養(yǎng)條件下，冷刺激組的apoE-/-小鼠血漿脂聯(lián)素水平明顯低于30℃對(duì)照組，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 5.脂聯(lián)素治療對(duì)冷刺激條件下apoE-/-小鼠的影響冷刺激條件下，脂聯(lián)素治療組（4℃-Adipo）apoE-/-小鼠的血漿總膽固醇水平明顯低于4℃空白對(duì)照組(4℃-VT)，高于30℃組;4℃-Adipo組小鼠血漿LDL-C水平明顯低于4℃-VT組，仍高于30℃。
　　

58、冷刺激條件下，脂聯(lián)素治療組apoE-/-小鼠的sWAT、eWAT和iBAT組織的UCP1蛋白表達(dá)水平明顯高于4℃空白對(duì)照組，并具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;冷刺激條件下，脂聯(lián)素治療組apoE-/-小鼠的主動(dòng)脈根部斑塊面積明顯低于4℃空白對(duì)照組，并具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;冷刺激條件下，脂聯(lián)素治療組apoE-/-小鼠的斑塊的易損指數(shù)也明顯低于4℃空白對(duì)照組，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;冷刺激條件下，脂聯(lián)素治療組apoE-/-小鼠的斑塊壞死核心面積明顯低于4

59、℃-VT組，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;冷刺激條件下，脂聯(lián)素治療組apoE-/-小鼠的斑塊的纖維帽厚度則明顯高于4℃-VT組，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，冷刺激條件下脂聯(lián)素治療組apoE-/-小鼠的sWAT、eWAT和iBAT組織的UCP1基因mRNA表達(dá)水平明顯低于4℃的空白對(duì)照組，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;western-blotting檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)，冷刺激條件下，脂聯(lián)素治療組apoE-/-小鼠的sWAT、

60、eWAT和iBAT組織的UCP1蛋白表達(dá)水平也明顯低于4℃組的空白對(duì)照組，甚至在sWAT和iBAT中，4℃-Adipo組UCP1蛋白表達(dá)水平明顯低于30℃組小鼠，并具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.β3-腎上腺素能受體激動(dòng)劑CL-316243活化BAT/BRITE，改變apoE-/-血脂水平，影響AS進(jìn)程。
　　 2.β3-腎上腺素能受體拮抗劑SR59230A阻斷了冷刺激對(duì)apoE-/-小鼠AS進(jìn)程