SARAF蛋白對動(dòng)脈粥樣硬化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：建立ApoE基因敲除大鼠（Apolipoprotein E-deficient Rats，ApoE-/-Rats）動(dòng)脈粥樣硬化模型及培養(yǎng)大鼠巨噬細(xì)胞，探討鈣庫操作性Ca2+內(nèi)流調(diào)節(jié)因子（Store-Operated Calcium Entry Associated Regulatory Factor,SARAF）在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用及機(jī)制。
　　方法：
　　第一部分、建立ApoE基因敲除大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型
　

2、　將8周齡ApoE基因敲除大鼠共16只，分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，予高脂飼料喂養(yǎng)12周。實(shí)驗(yàn)組在干預(yù)的前4周予2004型Alzet滲透泵植入大鼠皮下，內(nèi)部填充血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ,AngⅡ）,濃度為25mg/ml，以0.25μl/hr的速率穩(wěn)定釋放28天。對照組僅予等量生理鹽水。檢測血壓、心率、體重，12周后麻醉取血并處死，檢測炎癥因子白細(xì)胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、腫瘤壞死因子-α、（Tumo

3、r necrosis factor-α,TNF-α），血脂TC、TG、HDL、LDL；取心臟及主動(dòng)脈組織制備病理切片，作HE、油紅O、Masson染色，評估動(dòng)脈粥樣硬化斑塊情況；采用實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)（qPCR）以及蛋白免疫印跡法（western-blotting）檢測主動(dòng)脈SARAF、TNF-α、IL-1β表達(dá)。
　　第二部分、SARAF蛋白對巨噬細(xì)胞炎癥因子的調(diào)節(jié)作用
　　將NR8383巨噬細(xì)胞分為對照組（Bl

4、ank），ox-LDL組，空病毒干擾組(NC+ox-LDL)，SARAF過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染組(SARAF+ ox-LDL)。分別以空載體慢病毒和過表達(dá)SARAF載體慢病毒，轉(zhuǎn)染 NC+ox-LDL組和SARAF+ox-LDL組各24h，ox-LDL（終濃度100μg/ml）干預(yù)ox-LDL組、NC+ox-LDL組和SARAF+ox-LDL組各24h，采用western blotting技術(shù)檢測各組SARAF、TNF-α、IL-1β表達(dá)

5、。
　　再將NR8383巨噬細(xì)胞分為對照組（Blank），ox-LDL組，空病毒載體干擾組(NC+ox-LDL)，si-SARAF慢病毒干擾載體組（si-SARAF+ox-LDL）。分別以空載體慢病毒和si-SARAF干擾載體慢病毒，轉(zhuǎn)染NC+ox-LDL組和si-SARAF+ox-LDL組各24h，ox-LDL（終濃度100μg/ml）干預(yù)ox-LDL組、NC+ox-LDL組和si-SARAF+ox-LDL組各24h，weste

6、rn blotting檢測SARAF、TNF-α、IL-1β表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立ApoE基因敲除大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，大鼠主動(dòng)脈根部粥樣斑塊明顯；
　　2.實(shí)驗(yàn)組ApoE基因敲除大鼠的主動(dòng)脈SARAF蛋白及炎癥因子TNF-α、IL-1β表達(dá)升高；
　　3.SARAF過表達(dá)組NR8383巨噬細(xì)胞炎癥因子IL-1β、TNF-α表達(dá)增加；
　　4.SARAF基因干擾組NR8383巨噬細(xì)胞IL-1β