HERG錯(cuò)義突變A422T和H562P導(dǎo)致LQT綜合征的細(xì)胞分子機(jī)制.pdf

1、HERG鉀通道電流是心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的重要組分,在3期復(fù)極化晚期發(fā)揮關(guān)鍵作用。藥物的阻斷作用或HERG基因突變?cè)斐稍撾娏鳒p少,可分別導(dǎo)致獲得性LQTS和遺傳性LQTS(LQT2)。就LQT2而言,目前已發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)有200多個(gè),但致病機(jī)制各不相同。
　　 A422T和H562P是從兩個(gè)不同家庭LQTS病人篩選到的錯(cuò)義突變位點(diǎn),電生理分析結(jié)果顯示,這兩種不同位點(diǎn)突變通道電流明顯減小,功能缺失,但具體的發(fā)生機(jī)制是何,尚不清楚。本課

2、題利用膜片鉗技術(shù)結(jié)合細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù),研究分析A422T和H562P突變導(dǎo)致HERG鉀通道功能缺失的機(jī)制,并探討不同方法的挽救效果,為理解通道蛋白運(yùn)輸缺陷導(dǎo)致HERG鉀通道功能缺失、造成LQT2的細(xì)胞分子機(jī)制提供詳實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù),同時(shí)為L(zhǎng)QTS疾病的臨床治療提供新視點(diǎn)。
　　 主要結(jié)果如下:
　　 1.首先,利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),對(duì)分別表達(dá)A422T和H562P突變通道的HEK293細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種錯(cuò)義突變均可

3、導(dǎo)致HERG鉀通道電流幅度減少,電壓依賴性消失,說(shuō)明A422T和H562P存在不同程度的功能缺失。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,A422T和H562P通道的155 kDa成熟蛋白組分消失,提示突變蛋白存在轉(zhuǎn)運(yùn)障礙。這一結(jié)果進(jìn)一步在免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)得到證實(shí),表現(xiàn)在A422T與H562P突變通道蛋白膜分布減少,胞質(zhì)內(nèi)蛋白增加,且與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共定位,說(shuō)明兩種突變通道蛋白由于轉(zhuǎn)運(yùn)障礙而被滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)。
　　 2.其次,將WT與

4、A422T或H562P的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)HEK293細(xì)胞,利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)及western blot檢測(cè)的結(jié)果顯示,雜合型通道的電流及成熟蛋白表達(dá)均顯著少于WT,并且隨著轉(zhuǎn)染突變體質(zhì)粒量的增加,通道功能和蛋白表達(dá)受損加重,說(shuō)明A422T、H562P對(duì)WT的電流及蛋白表達(dá)有濃度依賴的負(fù)顯性抑制作用。進(jìn)一步對(duì)A422T／WT’(轉(zhuǎn)染時(shí)質(zhì)粒的量為1:1,模擬病人常見雜合基因型)、H562P／WT(轉(zhuǎn)染時(shí)質(zhì)粒的量為1:1,模擬病人常見雜合基因型)的

5、電生理特性進(jìn)行檢測(cè)分析,其結(jié)果表明,除成熟蛋白表達(dá)減少外,雜合型通道的動(dòng)力學(xué)與WT相比也有改變,A422T／WT主要表現(xiàn)在激活過程減慢,而H562P／WT表現(xiàn)在失活過程加快。而與A422T／WT相比,H562P／W工具有更快激活,更快失活的特點(diǎn),這將使通道得開放時(shí)間縮短,進(jìn)而顯著影響動(dòng)作電位復(fù)極化的鉀離子流。這種動(dòng)力學(xué)的改變是導(dǎo)致雜合型通道功能缺陷的另一原因。
　　 3.進(jìn)一步利用不同方法對(duì)A422T、H562P突變通道進(jìn)行處理

6、,比較其對(duì)電流及蛋白表達(dá)的挽救作用,分析兩突變體的結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的分子機(jī)制。在低溫或E4031處理?xiàng)l件下,A422T突變通道的功能和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)均可得到顯著改善,不但再次證明A422T突變通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)障礙發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),并且說(shuō)明該突變通道蛋白可形成基本的四聚體結(jié)構(gòu)及孔道結(jié)構(gòu),系一種錯(cuò)誤折疊不嚴(yán)重的突變蛋白；相反,兩種處理對(duì)H562P突變通道卻無(wú)效,說(shuō)明其蛋白折疊錯(cuò)誤嚴(yán)重,無(wú)法被常用方法挽救。
　　 在過表達(dá)Hsp70和／或Hsp90的

7、情況下,Co-IP檢測(cè)證實(shí)A422T或H562P與Hsp70和Hsp90三者之間存在相互作用,并且與野生型HERG鉀通道蛋白相比,突變通道蛋白與Hsp70或Hsp90的結(jié)合量也不同；過表達(dá)Hsp70和Hsp90對(duì)A422T突變通道電流有部分挽救作用,而對(duì)蛋白表達(dá)沒有顯著影響；這種挽救作用存在于單獨(dú)過表達(dá)Hsp90而不是Hsp70的條件下,雷公藤紅素-Hsp90的抑制劑可取消其挽救作用。這些說(shuō)明Hsp70、Hsp90均參與HERG鉀通道蛋

8、白的轉(zhuǎn)運(yùn)過程,但Hsp90對(duì)A422T的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)更為重要。對(duì)H562P突變通道而言,盡管與Hsp70和Hsp90存在相互作用,但無(wú)論過表達(dá)Hsp70和／或Hsp90,對(duì)其功能和蛋白表達(dá)都無(wú)明顯影響,進(jìn)一步說(shuō)明兩種不同位置的錯(cuò)義突變,影響其功能的機(jī)制存在差異。H562P突變無(wú)法被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制系統(tǒng)糾正。
　　 在適度低氧刺激(2％O2作用24 hr)下,對(duì)WT通道電流及蛋白成熟過程均有明顯促進(jìn)作用,也可使A422T突變通道功能部分

9、恢復(fù),但對(duì)H562P無(wú)影響。提示適當(dāng)?shù)膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)可以促進(jìn)HERG鉀通道蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)、成熟。
　　 4.最后,利用反轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)XBP1的剪切情況,了解兩突變體是否在細(xì)胞內(nèi)過度堆積,引起ER stress。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明A422T和H562P突變通道蛋白雖然阻滯于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,但并未過多堆積,也未造成ER stress,而是及時(shí)進(jìn)入泛素-蛋白酶體途徑進(jìn)行降解。
　　 結(jié)論:
　　 1.HER