PRKAG2基因新突變導致中國人PRKAG2心臟綜合征的發(fā)病機制研究.pdf

1、PRKAG2 G100S是于2007年在一個中國人心肌肥厚合并傳導異常及心室預激家系中發(fā)現的一個新的PRKAG2基因錯義突變。該家系患者臨床表現有心肌肥厚(56％)、預激綜合征(46％)、竇房結功能不良或高度房室傳導阻滯、猝死，有的還伴有房顫、房撲等房性心律失常，符合國外PRKAG2心臟綜合征家系報道的共性。經過對該家系成員進行PRKAG2基因測序，發(fā)現PRKAG2基因第3外顯子上出現第100位甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸(PRKAG2 G100

2、S)，考慮其可能是導致該家系患者心肌肥厚及傳導系統(tǒng)異常的致病基因，因此我們認為PRKAG2 G100S可能導致中國人PRKAG2心臟綜合征的發(fā)生。2001年Gollob等提出PRKAG2心臟綜合征是一種心臟特異的糖原綜合征的假說，認為心肌肥厚及心室預激等臨床表型可能與心肌細胞內的過度糖原累積有關。此后，有研究認為PRKAG2基因可能參與心臟的發(fā)育過程并導致心臟旁道的形成，因此研究人員認為應從心臟發(fā)育和能量代謝異常的視角了解PRKAG2突

3、變的致病機制。然而，最近研究發(fā)現心肌糖原累積并不能完全說明心肌肥厚的發(fā)病機制，AMPK的異?；罨赡苡绊懠毎麅刃盘栟D導途徑從而導致心肌肥厚。PRKAG2 G100S是首次發(fā)現的一個導致中國人PRKAG2心臟綜合征的新突變，在國內外均未見報道，其引起家系患者心肌肥厚的致病機制還不清楚。為明確PRKAG2 G100S突變對心肌細胞糖代謝和心肌肥厚標志基因表達的影響，深入認識PRKAG2心臟綜合征的疾病本質，本課題通過在SD乳鼠心肌細胞及I9

4、c2胚胎心肌細胞中過表達PRKAG2 G100S突變基因，研究該突變基因是否引起心肌細胞內糖原累積、Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡、心肌肥厚標志基因表達增加，初步闡明PRKAG2 G100S新突變引起中國人PRKAG2心臟綜合征的致病機制。
　　 目的：研究PRKAG2 G100S新突變對心肌細胞內糖代謝、Ca2+穩(wěn)態(tài)以及心肌肥厚標志基因表達的影響。
　　 方法：(1)攜帶野生型及突變型PRKAG2基因的重組腺病毒載體構建：利用Inv

5、itrogen的GatewayTM技術，通過重疊PCR技術將目的基因突變體PRKAG2G100S-IRES-EGFP及野生型PRKAG2-IRES-EGFP定向BP重組至入]載體pDONR221上，然后與腺病毒載體pAd/CMV/V5-DEST進行LR重組反應，形成共表達目的基因及增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的腺病毒表達克隆。經篩選陽性表達克隆并測序驗證后，PacI酶切、包裝、擴增、純化獲得攜帶EGFP及PRKAG2基因的重組體腺病毒

6、。病毒PCR鑒定并確定病毒滴度。(2)乳鼠心肌細胞的培養(yǎng)及重組腺病毒感染心肌細胞：培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，用重組腺病毒感染并使用Westerr blot技術鑒定PRKAG2蛋白是否在心肌細胞內正確表達。(3)重組腺病毒感染H92胚胎心肌細胞及細胞內Ca2+檢測：用構建好的重組腺病毒感染H9c2胚胎心肌細胞，使用Westernblot技術鑒定PRKAG2蛋白是否在心肌細胞內正確表達；以Roth-2/AM為鈣指示劑，使用流式細胞熒光定量技術檢測細

7、胞內Ca2+濃度。(4)重組腺病毒感染乳鼠心肌細胞及細胞內糖原含量、ANP、α-MHC、β-MHC基因水平檢測：用構建好的重組腺病毒感染SD乳鼠心肌細胞，使用periodic acid-schiff(PAS)染色檢測心肌細胞內糖原含量以及使用Real-time qPCR技術檢測心房利鈉肽(atrial natriuretic factor,ANP)、β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain,β-MHC)、α-肌球蛋白重

8、鏈(α-myosin heavy chain，α-MHC)mRNA的表達水平。
　　 結果：(1)成功構建了攜帶EGFP基因的PRKAG2突變體重組腺病毒及野生型重組腺病毒，PCR鑒定結果表明PRKAG2基因正確插入腺病毒載體。病毒的滴度為：Ad-PRKAG2-IRES-EGFP7.8×108ifu/ml， Ad-PRKAG2 G100S-IRES-EGFP8.4×108ifu/ml。(2)成功培養(yǎng)了SD乳鼠心肌細胞并建立了過表

9、達正?；蛲蛔働RKAG2基因的乳鼠心肌細胞模型；熒光顯微鏡下可見突變體及野生型重組腺病毒感染后的SD乳鼠心肌細胞表達EGFP而發(fā)出綠色熒光；Western blot證明PRKAG2蛋白成功在乳鼠心肌細胞中過表達。(3)在H9c2胚胎心肌細胞成功過表達正常或突變的PRKAG2基因，Western blot證明PRKAG2蛋白過表達成功;心肌細胞內Ca2+檢測顯示重組腺病毒感染H9c2胚胎心肌細胞24-48小時，突變(GS)組(12.72±

10、7.68)細胞漿內Ca2+濃度與陰性對照(PK)組(17.28±7.79)、空白對照(GFP)組(19.33±5.50)組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；重組腺病毒感染H9c2胚胎心肌細胞48-72小時，突變(GS)組(24.18±2.43)細胞漿內Ca2+濃度與陰性對照(PK)組(26.24±4.77)、空白對照(GFP)組(26.04±5.71)組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；重組腺病毒感染H9c2胚胎心肌細胞48小時前后

11、，突變(GS)組、陰性對照(PK)組及空白對照(GFP)組的細胞漿內Ca2+濃度差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。(4)重組腺病毒感染乳鼠心肌細胞后，檢測乳鼠心肌細胞糖原含量并檢測細胞內ANP、α-MHC、β-MHC的基因表達水平。PRKAG2 G100S突變使乳鼠心肌細胞質內有明顯糖原累積，而未突變組(陰性對照(PK)組、空白對照(GFP)組)糖原累積較少。重組腺病毒感染乳鼠心肌細胞48-72小時，突變(GS)組(1.00±0.04)

12、ANP mRNA水平與陰性對照(PK)組(1.00±0.10)、空白對照(GFP)組(1.00±0.06)間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；α-MHC mRNA水平，突變(GS)組(1.00±0.13)與陰性對照(PK)組(1.00±0.00)、空白對照(GFP)組(1.05±0.38)組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；β-MHC mRNA水平，突變(GS)組(1.04±0.33)與陰性對照(PK)組(1.00±0.04)、空白對

13、照(GFP)組(1.09±0.53)三組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 結論：(1)PRKAG2 G100S未能引起心肌細胞內鈣穩(wěn)態(tài)失衡，表明Ca2+及其依賴的信號轉導途徑可能未參與心肌肥厚的發(fā)病過程；同時表明PRKAG2 G100S導致的AMPK活性異常改變可能對心肌細胞鈣穩(wěn)態(tài)的影響較小。(2)PRKAG2 G100S未能引起心肌細胞內ANP、α-MHC及β-MHC mRNA水平明顯改變，表明其對ANP、α-MHC