KCNJ5基因Gly387Arg突變導(dǎo)致家族性長(zhǎng)QT綜合征.pdf

1、背景：心源性猝死嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，發(fā)病率高達(dá)0.1％-0.2％，僅在美國(guó)每年就可導(dǎo)致大約30萬(wàn)-40萬(wàn)人死亡。90％猝死的患者可以找到心臟病因，由于猝死后存活的患者有限，因此至少5％患者沒(méi)有潛在的心臟病原因，這些患者大多數(shù)年齡小于40歲，其中長(zhǎng)QT綜合征是引起這部分病人猝死的主要原因之一。長(zhǎng)QT綜合征又稱(chēng)心室復(fù)極延長(zhǎng)綜合征，其特征性表現(xiàn)是心電圖上QT間期延長(zhǎng)，T波異常，易產(chǎn)生尖端扭轉(zhuǎn)型室速和室顫。長(zhǎng)QT綜合征按病因通?？煞譃楂@得性和遺傳

2、性?xún)煞N類(lèi)型。獲得性長(zhǎng)QT綜合征雖也具有遺傳易感性，但主要與心肌局部缺血、電解質(zhì)紊亂和應(yīng)用某些藥物等因素有關(guān)，臨床上祛除這些誘發(fā)因素?？捎行е委煛６z傳性長(zhǎng)QT綜合征的發(fā)生機(jī)制要復(fù)雜得多，又無(wú)有效的治療措施，因此長(zhǎng)期以來(lái)一直是心律失常領(lǐng)域的研究焦點(diǎn)。從Jervell和Lange-Nielsen于1957年在世界上報(bào)道了第一個(gè)呈常染色體隱性遺傳的長(zhǎng)QT綜合征家系，至今已經(jīng)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了10個(gè)基因的數(shù)百個(gè)突變可導(dǎo)致10種不同類(lèi)型的長(zhǎng)QT綜合征，初

3、步揭示了部分長(zhǎng)QT綜合征的分子缺陷及其作用機(jī)制。然而，已經(jīng)識(shí)別出的10個(gè)長(zhǎng)QT綜合征致病基因只可以解釋大約80％的長(zhǎng)QT綜合征患者的病因和發(fā)病機(jī)制，仍有20％左右的長(zhǎng)QT綜合征患者的致病基因有待識(shí)別。不僅如此，由于長(zhǎng)QT綜合征既具有顯著地遺傳異質(zhì)性，不同患者的致病基因不一定相同，即使基因相同，致病突變也多不同：同時(shí)存在巨大的表型差異，同樣是長(zhǎng)QT綜合征患者，有的毫無(wú)癥狀，有的則出現(xiàn)暈厥和猝死等表現(xiàn)，因而有必要對(duì)所有無(wú)血緣關(guān)系的長(zhǎng)QT綜合

4、征尤其是家族性長(zhǎng)QT綜合征患者進(jìn)行分子學(xué)遺傳研究。 目的：定位新的家族性長(zhǎng)QT綜合征的致病基因座，識(shí)別新的家族性長(zhǎng)QT綜合征的致病基因，并在細(xì)胞水平研究其作用機(jī)制，為長(zhǎng)OT綜合征的早期診斷、預(yù)后評(píng)估、預(yù)防咨詢(xún)以及基因治療奠定基礎(chǔ)。 方法：收集長(zhǎng)QT綜合征家系和無(wú)血緣關(guān)系的健康對(duì)照者。采集外周靜脈血，常規(guī)抽提基因組DNA。在前期已經(jīng)排除了所報(bào)道的10個(gè)長(zhǎng)QT綜合征相關(guān)基因KCNQ1、KCNH2、SCN5A、Ankyrin

5、B、KCNE1、KCNE2、KCNJ2、CACNA1C、CAV3和SCN4B的基礎(chǔ)上，進(jìn)行微衛(wèi)星全基因組掃描、基因分型、單倍型和連鎖分析，確定候選基因在染色體上的座位。運(yùn)用生物信息學(xué)知識(shí)確定所定位區(qū)域的首選候選基因，通過(guò)PCR-測(cè)序和序列比對(duì)分析以期發(fā)現(xiàn)家族性長(zhǎng)QT綜合征先證者的基因突變。然后，分別在發(fā)生基因突變的家系和健康對(duì)照者中篩查所發(fā)現(xiàn)的突變基因，以評(píng)估該基因突變?cè)诓煌巳褐械牧餍新?，并?duì)比分析突變區(qū)域氨基酸在各物種間的保守性，初

6、步確定所發(fā)現(xiàn)的突變是致病突變而不是罕見(jiàn)的分子多態(tài)。運(yùn)用分子克隆技術(shù)克隆所發(fā)現(xiàn)的潛在致病基因的野生型，插入到克隆載體pGEM-T，針對(duì)所發(fā)現(xiàn)的突變通過(guò)定位誘變獲得該基因的突變體，再通過(guò)酶切反應(yīng)及測(cè)序證實(shí)后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，中量制備所識(shí)別出的長(zhǎng)QT綜合征基因的重組質(zhì)粒，在體外逆轉(zhuǎn)錄制備適量的野生型和突變型長(zhǎng)QT綜合征基因的cRNA，通過(guò)顯微注射裝置注入爪蟾卵母細(xì)胞，運(yùn)用雙電極電壓鉗在細(xì)胞水平研究突變基因產(chǎn)物所發(fā)生的電生理改變。 結(jié)果：

7、獲得了一個(gè)長(zhǎng)QT綜合征大家系和500例無(wú)血緣關(guān)系的健康對(duì)照者的臨床資料和血標(biāo)本，繪制了該家系的系譜圖，抽提了基因組DNA。通過(guò)微衛(wèi)星全基因組掃描獲得了家系成員的基因型，構(gòu)建了單倍型圖。通過(guò)連鎖分析，確定該家系長(zhǎng)QT綜合征的候選基因在染色體上的座位是11q23-24(在11號(hào)染色體上，兩標(biāo)記位點(diǎn)D11S990和D11S4123之間的5.34cM的間隔區(qū)域，其中在位點(diǎn)D11S4123在θ=0.00時(shí)得到最大的LOD值5.4183)。運(yùn)用生物

8、信息學(xué)知識(shí)確定所定位區(qū)域的首選候選基因?yàn)镵CNJ1和KCNJ5，通過(guò)PCR-測(cè)序和序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)家族性長(zhǎng)QT綜合征先證者的KCNJ5基因發(fā)生了一個(gè)改變氨基酸的雜和錯(cuò)義突變，即KCNJ5基因(基因登錄號(hào)NM_000890)第1473位的鳥(niǎo)嘌呤(即第387位密碼子的第一個(gè)核甘酸)變成了胞嘧碇(1473 G→C)，相應(yīng)地其所編碼的離子通道蛋白的第387位的甘氨酸變成了精氨酸(Gly387→Arg)。相同的突變存在于家系中所有的患者，但500

9、例無(wú)血緣關(guān)系的健康對(duì)照者均無(wú)此突變，也沒(méi)有在該家族性長(zhǎng)QT綜合征先證者中發(fā)現(xiàn)KCNJ1基因存在突變。多物種序列比對(duì)顯示KCNJ5基因Gly3 87→Arg突變具有高度保守性，初步確定所發(fā)現(xiàn)的突變是致病突變而不是罕見(jiàn)的分子多態(tài)。運(yùn)用分子克隆技術(shù)成功克隆了所發(fā)現(xiàn)的潛在致病基因KCNJ5的野生型，插入到克隆載體pGEM-T，針對(duì)所發(fā)現(xiàn)的突變通過(guò)定位誘變獲得該基因的突變體，再通過(guò)酶切反應(yīng)及測(cè)序證實(shí)后中量制備了該基因的重組質(zhì)粒，在體外逆轉(zhuǎn)錄制備了

10、適量的野生型和突變型KCNJ5的cRNA，通過(guò)顯微注射裝置注入爪蟾卵母細(xì)胞，全細(xì)胞雙電極電壓鉗研究發(fā)現(xiàn)KCNJ5的Gly387→Arg突變?yōu)楣δ塬@得性，使KCNJ5基因所編碼的鉀離子通道在所有電壓水平的電流密度均大幅度升高，在-50mV，突變型KCNJ5和野生型KCNJ5的電流密度分別為-23.2±1.2pA/pF(n=11)和-8.5±0.8pA/PF(n=8)(p<0.05)；電壓為-20mV時(shí)，兩者的電流密度分別為15.2±1.1