蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜鈣通透性通道滲透調(diào)節(jié)機(jī)制研究及擬南芥TPC1基因的克隆與鑒定.pdf

1、胞質(zhì)自由Ca2+是植物細(xì)胞普遍存在的第二信使，介導(dǎo)植物對體內(nèi)外多種刺激產(chǎn)生相應(yīng)反應(yīng)。細(xì)胞質(zhì)膜鈣通道介導(dǎo)的Ca2+向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)對于胞質(zhì)鈣信號(hào)產(chǎn)生至關(guān)重要，因此，對植物細(xì)胞質(zhì)膜鈣通道進(jìn)行研究并了解其調(diào)控機(jī)制，對于植物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)研究具有重要意義。 本論文第一部分工作以蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，利用膜片鉗等技術(shù)手段，對保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜鈣通道進(jìn)行記錄、鑒定并對其調(diào)控因素進(jìn)行研究，提出了滲透勢在調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)過程中可能的作用機(jī)制。利用Ba2+

2、作為通透性離子在全細(xì)胞水平記錄到內(nèi)向電流，逆轉(zhuǎn)電位及抑制劑實(shí)驗(yàn)分析表明，該電流為Ba2+通過質(zhì)膜鈣通道內(nèi)流形成。滲透勢和微絲參與了全細(xì)胞鈣通道電流的調(diào)控，胞外低滲和微絲解聚劑可以激活通道電流，且滲透勢的作用是通過改變微絲結(jié)構(gòu)進(jìn)而調(diào)控通道的活性。單通道水平在蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜上記錄到張力激活型和電壓依賴型兩類鈣通透性通道，其中張力激活型鈣通道的激活依賴于質(zhì)膜所受的張力，開放幾率與張力大小成正比，張力激活型鈣通道的開放還受跨膜電位調(diào)控，通道電

3、流幅度與質(zhì)膜超極化程度成正比，本實(shí)驗(yàn)條件下記錄到的張力激活型鈣通道電導(dǎo)為19.7pS；蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜上還存在有電壓依賴型鈣通道，其激活依賴于質(zhì)膜超極化，單通道電導(dǎo)為14.3pS。對這兩類通道電流分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)電位分析、抑制劑鑒定、跨膜Ba2+濃度依賴性及Ca2+通透性等特性鑒定，表明實(shí)驗(yàn)中所記錄的電流信號(hào)為跨質(zhì)膜鈣通透性通道的內(nèi)向電流。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，微絲參與了對張力激活型及電壓依賴型鈣通道的調(diào)控，微絲解聚后激活通道。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，滲透

4、勢對全細(xì)胞水平通道的激活作用至少部分通過張力激活型鈣通透性通道來介導(dǎo)。利用激光共聚焦顯微技術(shù)，測定滲透勢、微絲解聚劑等因素對蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體胞質(zhì)自由Ca2+濃度的影響，結(jié)果表明：胞外低滲、微絲解聚均可引起胞內(nèi)自由Ca2+濃度的升高，且微絲解聚劑可在高滲下引起胞質(zhì)Ca2+濃度升高，這些因素引起的Ca2+升高可以被胞外添加Ca2+通道抑制劑所抑制，說明胞內(nèi)Ca2+濃度升高依賴于胞外Ca2+的流入。在胞內(nèi)外都以Ca2+為通透離子的情況下，

5、發(fā)現(xiàn)蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜電壓依賴型鈣通道可以介導(dǎo)胞內(nèi)K+外流，這在氣孔保衛(wèi)細(xì)胞對內(nèi)外界刺激迅速作出反應(yīng)中有重要意義。實(shí)驗(yàn)過程中在蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜上還記錄到一類高電導(dǎo)的鈣通透性通道，單通道電導(dǎo)為正常通道電導(dǎo)的5倍，推測這類高電導(dǎo)通道的存在可能使某些保衛(wèi)細(xì)胞對逆境信號(hào)作出更加快速的反應(yīng)。 本論文另一部分工作對擬南芥可能鈣通道基因進(jìn)行克隆及功能鑒定?？寺〉降臄M南芥AtTPC1基因可以互補(bǔ)酵母電壓門控鈣通道CCH1的功能并恢復(fù)Ca2+吸收缺

6、陷型cch1的性狀。利用Promoter+GUS手段對AtTPC1基因進(jìn)行了幼苗到開花期植株的組織表達(dá)定位，結(jié)果顯示該基因在植株整體表達(dá)，但在各組織部位的表達(dá)強(qiáng)度不同。利用AtTPC1-GFP策略對瞬時(shí)表達(dá)的基因產(chǎn)物進(jìn)行亞細(xì)胞定位，基因槍轉(zhuǎn)化的洋蔥表皮細(xì)胞顯示，GFP熒光出現(xiàn)在膜結(jié)構(gòu)區(qū)域。利用電壓鉗系統(tǒng)對體外轉(zhuǎn)錄后的AtTPC1基因cRNA產(chǎn)物進(jìn)行電壓鉗記錄，沒有記錄到電流，同時(shí)轉(zhuǎn)錄表達(dá)的KAT1基因cRNA產(chǎn)物作為對照可以記錄到內(nèi)向電

7、流。利用AtTPC1基因功能缺失突變體及過表達(dá)突變體進(jìn)行性狀篩選，所選用的指標(biāo)為高鹽，低鉀，高、低鈣，高滲透勢及干旱脅迫，但未發(fā)現(xiàn)與野生型植株間有明顯差異。 綜上所述，本論文工作在電生理和分子生物學(xué)水平對植物細(xì)胞鈣離子通道進(jìn)行了研究：證明微絲骨架的動(dòng)態(tài)變化參與了質(zhì)膜鈣通透性通道活性的調(diào)控過程，提出了“滲透勢—微絲骨架—質(zhì)膜鈣通道—?dú)饪走\(yùn)動(dòng)”這一負(fù)反饋調(diào)控途徑的存在，同時(shí)證明滲透調(diào)控鈣通透性通道的作用，至少部分通過調(diào)控張力激活型鈣