HIF-1α在早期糖尿病腎臟纖維化易感性中的作用機制研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)作為糖尿病的嚴重并發(fā)癥，已經(jīng)成為導致終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的主要病因之一。據(jù)報道，在發(fā)達國家，糖尿病腎病是導致慢性腎臟疾病(chronic kidney disease，CKD)的首要原因。而在我國，糖尿病腎病是僅次于慢性腎小球腎炎導致CKD的第二大因素。這主要由兩方面造成:一是糖尿病發(fā)病率日趨升高以及

2、發(fā)病年齡年輕化;二是人口老齡化。腎臟纖維化是DN的主要病理表現(xiàn)形式，可能的病理機制包括:(1)高血糖導致血流動力學紊亂和代謝紊亂;(2)轉(zhuǎn)化生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等細胞因子的激活;(3)血管活性物質(zhì)代謝異常，比如一氧化氮合酶活性降低導致一氧化氮合成減少;(4)腎臟高濾過導致的氧耗增加以及細胞外基質(zhì)增多導致的氧氣彌散障礙。雖然目前臨床上有大量控制血壓、血糖、血脂及腎素-血管緊張素系統(tǒng)的相關(guān)藥物，但是仍舊不能延緩疾病進展。其高致殘率和致

3、死率，給患者家庭和社會帶來了沉重的精神和經(jīng)濟負擔。
　　有趣的是，有部分患者盡管血糖控制較好，仍無法避免進展為ESRD。而有些患者即使血糖控制不佳，腎功能卻能維持在穩(wěn)定的水平。一方面與個體的異質(zhì)性有關(guān);另一方面可能與一些促纖維化始動因素的存在有關(guān)。
　　本研究利用鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)誘導的1型糖尿病和Akita自發(fā)性1型糖尿病鼠（6-8周齡）合并單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral

4、 obstruction,UUO)。研究結(jié)果證實，同樣是UUO手術(shù)，糖尿病組小鼠腎臟損傷程度明顯高于非糖尿病組，包括纖維化、細胞凋亡和炎細胞浸潤。體外實驗同樣證實，高糖刺激下的小鼠腎小管上皮細胞在缺氧條件下fibronectin蛋白表達量高于其他各組。從這些現(xiàn)象可以看出，無論是體內(nèi)還是體外條件下，高糖組更易于發(fā)生纖維化。那么究竟是何種因素促使這種現(xiàn)象發(fā)生？其潛在的作用機制是什么？
　　為了闡述這個問題，我們將目光聚焦于明星分子——

5、缺氧誘導因子(hypoxiainducible factors，HIFs)。腎臟血流大約占心輸出總量的20％，但是由于腎臟特殊的生理解剖結(jié)構(gòu)以及豐富的代謝活動，導致腎臟極易出現(xiàn)缺氧。缺氧誘導因子是機體組織為適應(yīng)缺氧而產(chǎn)生的一類因子，主要包括HIF1、HIF2和HIF3，其中研究較多的為前兩種。HIF1和HIF2（統(tǒng)稱為HIF）屬于PAS(per/aryl-hydrocarbon-receptor nuclear translocator

6、/Sim，PAS)家族，是含有堿性螺旋-環(huán)－螺旋結(jié)構(gòu)(basic helix-loop-helix，bHLH)的一類轉(zhuǎn)錄因子。HIF是一種異原二聚體蛋白，包括α亞基β亞基。由于β亞基結(jié)構(gòu)與芳香羥受體核轉(zhuǎn)位蛋白（hydrocarbon-receptor nuclear translocator，ARNT）結(jié)構(gòu)相同，故又稱為ARNT。正常情況下，HIFβ亞基在細胞漿中穩(wěn)定表達，HIFα在翻譯后即被泛素-蛋白酶體復合物降解。當機體處于缺氧環(huán)境

7、時，HIFα無法經(jīng)泛素化途徑降解，轉(zhuǎn)移到細胞核中，與HIFβ以及CBP/p300結(jié)合形成穩(wěn)定復合物，調(diào)控下游相關(guān)靶基因表達，比如調(diào)節(jié)血管生成、紅細胞生成、糖酵解、細胞增殖、細胞凋亡，調(diào)整氧氣的分布和提高機體對缺氧的耐受力。
　　腎臟包含有多種細胞類型，并且在表達HIF方面存在差異。研究證實HIF1主要在腎小管和腎小球上皮細胞內(nèi)表達，而HIF2主要表達于血管內(nèi)皮細胞和間質(zhì)纖維化細胞中。有許多研究表明HIF在調(diào)控多種腎臟疾病具有重要作

8、用，比如缺血/再灌注相關(guān)急性腎損傷，5/6腎切除導致的慢性腎臟病等。對于HIF在調(diào)控糖尿病腎病纖維化方面所起的作用，目前仍存在諸多爭議。Nayak等學者證實糖尿病動物模型引起的腎小球及間質(zhì)纖維化中有HIF表達，Rosenberger等學者同樣發(fā)現(xiàn)HIF1α不僅表達于糖尿病動物模型，在糖尿病腎病患者的病理標本中同樣有HIF1α的表達。本研究證實HIF1α在早期糖尿病纖維化中高表達，在一定程度上反映了HIF1α可能在調(diào)控早期糖尿病纖維化方面

9、起一定作用。
　　研究方法：
　　首先，利用STZ誘導的1型糖尿病小鼠模型和C57BL/6J-Ins2Akita/+小鼠模型（由于6-8周齡年齡小鼠血糖升高僅有2-3周，可視為早期糖尿病模型），進行UUO手術(shù)，通過馬松三色染色及四型骨膠原熒光染色觀察腎臟組織的骨膠原沉積，利用Western blot觀察纖維化指標和HIF1α表達情況;利用巨噬細胞markerF4/80染色來評估腎臟組織內(nèi)的炎癥浸潤情況;腎臟組織細胞的凋亡主要

10、依賴原位末端轉(zhuǎn)移酶標記法（TdT-mediated dUTP mick-end labeling，TUNEL）。同時，運用體外細胞模型--小鼠腎小管上皮細胞(the mouse PT cell，BUMPT-306 cell)，進一步證實HIF1α在缺氧條件下高糖組的表達情況。明確HIF1α是否在糖尿病早期參與腎臟纖維化的形成。
　　其次，利用HIF1α的特異性抑制劑3-(5'-羥甲基-2'-呋喃基)-1-苯甲基吲唑{3-(5-hy

11、droxymethl-2-furyl)-1-benzylindazole，YC-1}干預細胞，通過Western blot觀察其對HIF1α和纖維化指標表達的影響。另外利用HIF1α shRNA轉(zhuǎn)染大鼠腎小管上皮細胞(renal proximal tubular cell，RPTC)和人胚腎細胞(human embryonickidney，HEK)293，沉默HIF1α在上述細胞系內(nèi)的表達，進一步觀察HIF1α和纖維化指標的表達。

12、>　　最后，利用HIF抑制劑YC-1干預行UUO后的Akita糖尿病小鼠，觀察纖維化相關(guān)指標及HIF1α的表達。為了深入研究HIF1α的作用，我們利用近端小管HIF1α特異性敲除(PT-HIF1α KO)小鼠和對照組(PT-HIF1αWT)小鼠，連續(xù)5天低劑量注射STZ誘導1型糖尿病模型，觀察發(fā)現(xiàn)PT-HIF1α KO小鼠較 PT-HIF1αWT小鼠而言，纖維化程度及腎損傷程度均較輕，進一步證實HIF1α與早期糖尿病腎病纖維化敏感性的關(guān)

13、系。
　　研究結(jié)果：
　　(1) Akita小鼠和STZ誘導的1型糖尿病小鼠分別行UUO手術(shù)后，腎臟組織內(nèi)骨膠原沉積呈時間依賴性上升，纖維化指標fibronectin，α-SMA表達上升，同時伴隨HIF1α表達升高，且糖尿病組明顯高于同期對照組。此外，糖尿病組腎臟組織細胞凋亡程度明顯高于同期對照組，炎癥指標F4/80結(jié)果顯示手術(shù)后炎癥細胞浸潤明顯增加，且糖尿病組高于對照組。
　　(2) HIF1α的特異性抑制劑YC-1

14、干預BUMPT細胞，HIF1α表達下調(diào)的RPTC和HEK293細胞系都顯示一致結(jié)果，fibronectin的表達降低，且降低程度與HIF1α表達抑制程度一致。
　　(3) YC-1干預UUO后的Akita糖尿病小鼠模型及PT-HIF1α KO和PT-HIF1αWT糖尿病小鼠模型顯示，抑制HIF1α不僅可以降低骨膠原沉積、細胞外基質(zhì)纖維化等指標的表達，還可以減少腎臟組織細胞凋亡和間質(zhì)炎癥細胞浸潤。
　　結(jié)論：
　　本課題