Epac分子對(duì)鼠GH3細(xì)胞系細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)激素合成分泌及其與細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號(hào)通路相互作用的研究.pdf

1、本文分為以下幾個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 cAMP誘導(dǎo)的垂體腺瘤 GH3細(xì)胞增殖與其下游效應(yīng)分子PKA和Epac的關(guān)系及Epac對(duì)GH3細(xì)胞增殖的影響
　　目的：驗(yàn)證cAMP激活對(duì)大鼠垂體腺瘤GH3細(xì)胞增殖的影響，探究其下游效應(yīng)分子PKA和Epac在其中發(fā)揮的作用，證實(shí)Epac與GH3細(xì)胞系增殖之間的關(guān)系
　　方法：首先采用CCK8法，研究 cAMP激活劑Forskolin及PKA和Epac的抑制劑對(duì) GH3細(xì)胞增

2、殖的作用。然后以 Epac特異性激活劑8-pCPT-2’-O-Me-cAMP作用于GH3細(xì)胞，分別采用CCK8法和EDU法在細(xì)胞水平和DNA水平上證實(shí)Epac激活對(duì)GH3細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果：Forskolin激活cAMP后可以明顯促進(jìn)GH3細(xì)胞的增殖，PKA和Epac抑制劑可以分別部分抑制這種促增殖效應(yīng)，但抑制以后的GH3細(xì)胞增殖仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。8-pCPT-2’-O-Me-cAMP特異性激活 Epac對(duì) GH3細(xì)胞產(chǎn)生

3、促增殖作用，且呈濃度依賴效應(yīng)。
　　結(jié)論：cAMP激活對(duì)GH3細(xì)胞產(chǎn)生的促增殖作用可分別通過(guò)其下游效應(yīng)分子PKA和Epac來(lái)實(shí)現(xiàn)。單獨(dú)特異性激活Epac亦可促進(jìn)GH3細(xì)胞增殖。
　　第二部分 Epac激活促進(jìn) GH3細(xì)胞系 MAPK信號(hào)通路磷酸化ERK1/2表達(dá)增加但對(duì) CREB磷酸化無(wú)影響
　　目的：研究cAMP激活后對(duì)GH3細(xì)胞內(nèi)ERK1/2和CREB的影響及其與Epac的關(guān)系，探索cAMP-Epac激活后的下游信

4、號(hào)傳導(dǎo)通路
　　方法：首先分別用PKA和Epac抑制劑作用于GH3細(xì)胞后，Western blotting檢測(cè)Forskolin激活cAMP后對(duì)GH3細(xì)胞p-ERK1/2和p-CREB表達(dá)的影響。然后以Epac激活劑和抑制劑，或SiRNA干預(yù)細(xì)胞，以及B-Raf抑制劑作用于GH3細(xì)胞，Western blotting檢測(cè)其p-ERK1/2表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：cAMP激活后明顯促進(jìn)GH3細(xì)胞p-ERK1/2表達(dá)，這種促進(jìn)作

5、用可分別被PKA和EPAC抑制劑部分抑制。CAMP激活后明顯促進(jìn)GH3細(xì)胞p-CREB表達(dá)，這種促進(jìn)作用只能被PKA抑制劑抑制，但不能被Epac抑制劑抑制。Epac特異性激活亦可促進(jìn)GH3細(xì)胞p-ERK1/2表達(dá)，藥物阻斷B-Raf可以抑制這種作用。
　　結(jié)論：GH3細(xì)胞中，cAMP激活后與MAPK/ERK產(chǎn)生交叉通訊，并促進(jìn)p-ERK1/2表達(dá)增加，這種效應(yīng)可被PKA和Epac分別介導(dǎo)。cAMP激活對(duì)p-CREB促表達(dá)作用的影響

6、與Epac無(wú)關(guān)。cAMP-Epac與MAPK/ERK產(chǎn)生的交叉通訊需要B-Raf的參與。
　　第三部分 Epac激活對(duì) GH3細(xì)胞的促增殖作用與 B-Raf及MAPK/ERK信號(hào)通路的關(guān)系
　　目的：研究Epac激活后對(duì)GH3細(xì)胞的促增殖作用與MAPK/ERK信號(hào)通路的關(guān)系及B-Raf在其中發(fā)揮的作用
　　方法：使用MAPK/ERK和B-Raf的抑制劑干預(yù)GH3細(xì)胞，再以Epac特異性激活劑處理細(xì)胞，CCK8法檢測(cè) G

7、H3細(xì)胞增殖水平的變化。Western blotting檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白cyclin D3的表達(dá)水平改變。
　　結(jié)果：細(xì)胞水平上， Epac激活對(duì) GH3細(xì)胞產(chǎn)生的促增殖作用可以被MAPK/ERK和B-Raf的抑制劑完全抑制。在蛋白水平上，Epac激活促進(jìn)GH3細(xì)胞cyclin D3的表達(dá)增加效應(yīng)也被MAPK/ERK和B-Raf的抑制劑。
　　結(jié)論：Epac激活后對(duì)GH3細(xì)胞的促增殖作用是通過(guò)MAPK/ERK的激活來(lái)實(shí)現(xiàn)的，

8、B-Raf也在其中發(fā)揮了介導(dǎo)作用。
　　第四部分 Epac激活對(duì)GH3細(xì)胞生長(zhǎng)激素合成和分泌的作用
　　目的：研究特異性激活Epac后對(duì)GH3細(xì)胞生長(zhǎng)激素合成和分泌的作用。
　　方法：特異性Epac激活劑作用于GH3細(xì)胞特定時(shí)間，然后以Real-time PCR檢測(cè)生長(zhǎng)激素mRNA表達(dá)變化。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Elisa）方法檢測(cè)GH3細(xì)胞胞內(nèi)和培養(yǎng)基中生長(zhǎng)激素的水平。
　　結(jié)果：Epac激活后，對(duì)GH3細(xì)胞生長(zhǎng)