受體相互作用蛋白激酶3轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)特性研究.pdf

1、目的：探討受體相互作用蛋白激酶3(receptor interacting protein kinase3, RIPK3)基因啟動子功能序列與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用及其CpG島甲基化狀態(tài)與基因表達(dá)水平的關(guān)系。
　　方法：（1）采用生物信息學(xué)預(yù)測并分析啟動子序列后，行啟動子缺失突變轉(zhuǎn)化分析，即PCR方法對RIPK3基因不同長度的序列片段進(jìn)行擴(kuò)增，以熒光素酶載體構(gòu)建質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞（293T細(xì)胞），采用化學(xué)發(fā)光儀檢測區(qū)域啟動活性，鑒定

2、功能啟動子的可能區(qū)域。利用軟件預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，并通過突變轉(zhuǎn)化分析鑒定RIPK3基因核心轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點。（2）在293T細(xì)胞中，通過檢測過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子刺激蛋白1(stimulating protein1, Sp1)/刺激蛋白3(stimulating protein3, Sp3)和Sp1/Sp3顯性負(fù)突變體后以及基因選擇性Sp1抑制劑光神霉素處理后啟動子活性的檢測研究轉(zhuǎn)錄因子刺激蛋白家族與RIPK3啟動子之間的關(guān)系。（3）采用凝

3、膠電泳遷移分析（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）檢測轉(zhuǎn)錄因子Sp1/Sp3與RIPK3啟動子之間的相互作用關(guān)系。（4）采用RNA干擾技術(shù)檢測轉(zhuǎn)錄因子Sp1/Sp3在293T細(xì)胞中與RIPK3啟動子的相互作用以及在人大腸癌細(xì)胞（HT-29細(xì)胞）中與RIPK3表達(dá)的作用情況。（5）采用亞硫酸氫鹽修飾后測序法（Bisulfite sequencing PCR, BSP）研究在表達(dá)與不表達(dá)R

4、IPK3的細(xì)胞系中以及甲基化抑制劑處理后的不表達(dá)RIPK3的細(xì)胞系中甲基化在RIPK3基因啟動子區(qū)域的修飾情況。
　　結(jié)果：（1）化學(xué)發(fā)光實驗表明：RIPK3基因的5'非翻譯區(qū)(5'-non-translated region,5'UTR)和轉(zhuǎn)錄起始位點(transcriptional start site, TSS)上游19個堿基片段是RIPK3基因啟動子的功能序列；缺失突變轉(zhuǎn)化分析提示該功能序列包含三個GC盒(GC box)，

5、其中第二個為RIPK3基因轉(zhuǎn)錄因子Sp1/Sp3的核心結(jié)合位點。（2）過表達(dá)研究結(jié)果表明，Sp1/Sp3對RIPK3基因啟動子活性激活起主導(dǎo)作用。（3）凝膠電泳遷移分析的結(jié)果證實轉(zhuǎn)錄因子Sp1/Sp3與GC富集區(qū)特異性相互作用。（4）Sp1小干擾RNA或 Sp3小干擾RNA與RIPK3啟動子功能區(qū)和熒光素酶載體構(gòu)建的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，比較得出RIPK3啟動子活性明顯減低。（5）亞硫酸氫鹽修飾后測序法實驗結(jié)果表明，在表達(dá)RIPK3

6、的HT-29細(xì)胞系中RIPK3基因啟動子功能序列低度甲基化，在不表達(dá)RIPK3的結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT-116細(xì)胞）中RIPK3啟動子功能序列呈現(xiàn)高度甲基化。5-氮-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-CdR)處理后，HCT-116細(xì)胞里RIPK3啟動子功能序列甲基化的頻率明顯下降，RIPK3表達(dá)相應(yīng)上調(diào)。
　　結(jié)論： RIPK3基因的5'UTR及TSS上游19個堿基序列片段是RIPK3基因啟動子