ghrelin對gh3細胞膜電位的作用

1、中 國康 復(fù) 理 論 與 實踐 2 0 0 5年 1 1 月 第 1 1卷 第 1 1 期 C h i nJRe h a b i lTh e o r yP r a c t i c e ，N o v e mb e r2 0 0 5 ， Vo l1 1 ，No ． 1 1G h r e l i n對 GH 3細胞 膜 電位 的作 用 韓 雪峰 朱運龍 陳晨 · 基 礎(chǔ) 研 究 ·[ 摘要]目的 觀察 g h r e l

2、i n對 GH3細胞膜電位的作 用。方法 用 Ny s t a t i n打孔全細胞 記錄跨 膜 電流 ， 觀 察 g h r e l i n組 和對 照 組 GH3細胞 膜 電位 。結(jié) 果 對 照 組 細 胞 的膜 電位 為 一 ( 7 2 士 4 ． 7 8 )mV， 在 g h r e l i n處 理 后 ， 膜 電位 減 小 到 ( 5 4 ． 8 ± 4 ． 5 8 )mV。 結(jié) 論 g h r l e i n可

3、以快 速 、 可 逆 、 顯 著 性 地 降低 GH3 細 胞 膜 電位 。[ 關(guān)鍵詞]g h r e l i n ； 膜片鉗 ； 膜 電位 ； 生長激素 R e d u c t i o no fme mb r a n ep o t e n t i a li nG H 3c e l l sw i t hg h r e l i nHAN Xu e - f e n g， Z HUY u n — l o n g， C HE N C h e

4、 n ．De p a r t me n to fP h y s io l o g y ， t h eFo u r t hM i l i t a r yM e di c a lUn i v e r s i t y ，7 1 O 0 3 2 X i ' A n， S h a n xi ，Ch i n a[ A b s t r a c t ] O b j e c t i v eT oi n v e s t i g a t et h e

5、i nv i t r oe f f e c to fg h r e l i no nme mb r a n eme mb r a n ep o t e n t a i lo fGH3c e l l s ． Me t h o d sNy s —t a t i n - p e r f o r a t e dwh o l e - c e l lr e c o r d i n gc o n f i g u r a t i o nwa su s

6、e d ．Re s u l t sTh eme mb r a n ep o t e n t a i lo fGH 3wa sd e c r e a s e df r o m 一 ( 7 2 - + -4 ． 7 8 )mV t o( 5 4 ． 8 ± 4 ． 5 8 )mV ( P< O ． O 1 )a f t e ra p p l i c a t i o no fg h r e l i n ( 1 0 一～ 1

7、0 ～ M ) Co n c l u s i o nGh r e l i nc a nt r a n s i e n t l ya n ds i g n i f —i c a n t l yd e c r e a s e dt h ea mp l i t u d eo fme mb r a n ep o t e n t a i l ，wh i c hma yc o n t r i b u t et ot h eg h r e l i n

8、 - s t i m u l a t e dGH s e c r e t i o nf r o m GH 3c e l l s ．[ K e yw o r d s ]g h r e l i n ；p a t c h — c l a mp ； me mb r a n ep o t e n t a i l ； g r o w t hh o r mo n e中 圖 分 類 號 ： R 3 3 8 ． 2文 獻 標 識 碼 ： A文章 編

9、號 ： 1 0 0 6 — 9 7 7 1 ( 2 0 0 5 ) 1 1 — 0 9 2 7 — 0 2[ 本文著錄格式] 韓雪 峰 ， 朱運龍 ， 陳晨． G h r e l i n對 GH3細胞 膜 電位的作 用[ J ] ． 中 國康 復(fù)理 論 與實 踐 ， 2 0 0 5 ， 1 1 ( 1 1 ) ： 9 2 79 28 ．Gh r e l i n 是 一個 含 2 8氨 基 酸 的 肽 ， 作 為 目前 唯 一 的內(nèi)源性促

10、 生長 激素釋 放物 ( GHS ) 作 用于促 生 長激素 釋放 物受體 l a ( GHS — R。) ， 可 以刺 激 垂 體 生 長激 素 釋 放 ] 。G h r e l i n的促 GH 分 泌 作 用 被認 為 涉 及 多種 信 號傳 導(dǎo)途徑 ， 最 終使 細 胞 內(nèi)游 離鈣 離 子 濃 度 升 高而 刺 激 生長激 素 釋放 [ 2 。 ] 。在 GH3細 胞 上 發(fā) 現(xiàn) 有 GHS - R的表達 ， 我們 用其 來研

11、 究 g h r e l i n對 細胞 膜 電位 的作 用 。1 材 料 和 方 法 1 ． 1 試 劑和 藥 品 DME M 粉 、 F 1 2粉 、 HE P E S 、 Na H—C O 3 溶液 和 T r y p s i n ： T r a c eB i o s c i e n c e sP t yL t d ； 大 鼠 g h r e l i n ： Au s p e p ； Ny s t a t i n 、 a p a

12、mi n 、 c h a r y b d o t o x i n 和 所 有的鹽溶 液 ： S i g ma ； GH3細胞 ： ATC C。1 ． 2 細胞培 養(yǎng) GH3細 胞 置 1 7 5c m。 培 養(yǎng) 器 中單 層 培養(yǎng) ， 培 養(yǎng)液 包 括 4 5D ME M、 4 5F 1 2 、 1 0小 牛血 清及 1青 霉素 和鏈 霉 素 ( 均 為 v ／ v ) 。培 養(yǎng) 箱 條件 為 59 ／ 6 C O。 ， 3 7℃ 。培

13、 養(yǎng)液 每 2d換 1次 。細胞 生 長達到 對數(shù)生 長期時 ， 用適量 胰 蛋 白酶消 化 3mi n ； 加 入 適量 培養(yǎng)液終 止消化 ， 收集 細胞 ， 1 5 0 0r ／ mi n離 心 5mi n ， 棄 上清 ， 用 培養(yǎng)液 重懸細 胞 ， 取 適量 細胞 種植 于 新 的培養(yǎng) 器 中， 以 留后用 。再取 適量 細胞 種 植于 3 5mm 培 養(yǎng)皿 中， 每 2d天 換 1次 培 養(yǎng) 液 ， 2 ～7d后 進 行 電生

14、 理 實 驗 。作者單位 ： 7 1 0 0 3 2陜西西安市 ， 第四軍醫(yī)大學生理學教研 室。作 者 簡介 ： 韓雪峰( 1 9 7 3 一 ) ， 男 ， 內(nèi)蒙 古包頭市人 ， 碩士 ， 講師 ， 主要研究方 向 ；神 經(jīng) 免 疫 內(nèi)分 泌 。1 ． 3 電流鉗 記 錄 實驗 前 ， 用 膜 片 鉗細 胞記 錄外 液置 換 培養(yǎng) 液 1 0 ～3 0mi n ， 跨 膜 電流 用 “ g i g s e a l ”Ny s t a

15、t i n打孔全 細胞方 法記 錄 。玻璃 微 電極 經(jīng)拋 光后 輸 入 電 阻 達到 5 ～8MQ， 所 有 的實 驗 記 錄均 使 用 Ax o p a t c h 2 0 0放 大 器 和 p C l a mp 軟 件 。 細 胞 外 液 為 ： Na C 11 4 0mmo l ／ L 、 KC 15mmo l ／ L、 C a C 1 22 ． 5mmo l ／ L、 Mg C 1 20 ． 5mmo l ／ L 、 T TX

16、0 ． 0 0 1mmo l ／ L、 C o C 1 21mmo l ／ L、g l u c o s e1 0mmo l ／ L、 1 0HE P E S1 0mmo l ／ L， p H 一 7 ． 4 ， 滲 透 壓 為 3 1 0mOs m。 電 極 內(nèi) 液 為 ： KC 15 5mmo l ／ L 、K 2 S 047 5mmo l ／ L、M g S 048mmo l ／ L、HE P E S1 0mmo l ／ L， p

17、H一7 ． 4 ， 滲透 壓 為 3 0 0m0s m，n y s t a t i nlO O u g ／ ml 。細 胞觀 察 和 操 作 使 用 Ol y mp u s倒 置 顯 微 鏡 。所 有實驗 均在 室溫 下 ( 2 0℃ ～2 5℃) 進 行 。在 相 同的實 驗條件 下 ， 每組取 5 例 樣本 。1 ． 4 統(tǒng) 計學 方 法 使 用 Ax o nI n s t r u me n tp C l a mp軟 件采 集 和分

18、 析數(shù) 據(jù) ， 數(shù) 據(jù) 表 示 為 (±s ) 。用 S t u d e n tS成對 t 檢 驗進行 統(tǒng)計 學分 析 。2 結(jié) 果 我們使 用 不 同濃 度 的 g h r e l i n ( 1 0～ 1 0 。 mmo l ／L ) ， 發(fā)現(xiàn) 在 1 0mmo l ／ L和 1 0mmo l ／ L之 間作用 沒 有 明顯差 異 ， 但 1 0mmo l ／ L則 作 用 較 小 。所 以結(jié)果 均 以 1 0mmo l

19、／ L下 為代 表 。正 常 對 照 組 細 胞 的膜 電位 為一 ( 7 2 ± 4 ． 7 8 )mV， 在 g h r e l i n處 理 后 ， 膜 電位 減小 到( 5 4 ． 8 - - 4 - _4 ． 5 8 )mV， 與給 藥 前 相 比， 其 膜 電位絕 對值顯 著減 小 ( P<0 ． 0 1 ) 。見 圖 1 ～ 圖 2 。維普資訊 http://www.cqvip.com 9 2 8中國康復(fù)理

20、論與實踐 2 0 0 5 年 1 1 月第 1 1 卷第 1 1 期 C h i nJR e h a b i lT h e o r yP r a c t i c e ， N o v e mb e r2 0 0 5 ， V o l1 1 ， N o ． 1 1。 。 ．J I叫 。 nl I l I I - ．‘ - - ． I -‘ _ ‘I - I L 1 ．-lI l I I R I 一 1 1 1 1 1 - 『 - 

21、3; · 1 1 1 “ II I ' I ' I P I ' I TI mI “ 1 1 ' - r栩啊廂- -。 i m『Hg h r e l i n圖 1g h r e l i n對 G H 3細 胞 膜 電 位 的 影 響 3 討 論 目前 已知 ， 生 長 激 素 主 要 由下 丘 腦 的 調(diào) 節(jié) 性 激 素 GHRH 和 S S所 調(diào) 節(jié)[ 5 ] 。Gh r e l i n作 為

22、唯 一 的 內(nèi)源 性 GHS - R配體 ， 是 GH 調(diào) 節(jié) 的另一 個 重要 的神 經(jīng) 內(nèi)分 泌 途徑 。Gh r e l i n在體 和離體 ， 對 包 括人 類 和 嚙齒 類 動 物 在 內(nèi)的許 多物 種 都 有 強 烈 的 GH 促 分 泌作 用 ] 。Gh —r e l i n和 GHS - R在 下丘 腦 和垂 體 都有 表 達 ， 提 示 g h r e —l i n對 GH 的分泌作 用有 自分 泌 和旁分 泌效 應(yīng)l

23、 _ 1 ] 。生 長激素 細胞 分泌 生長激 素 需要 細 胞 內(nèi)鈣 離 子 的 參 與 ， 而鈣通 道 的 激 活 開放 需 要 細胞 膜 電位 產(chǎn) 生 可 興 奮 性變 化 ] 。垂體 生 長激 素 細胞 是 可 興 奮 細胞 ， 有 不 規(guī)律 的 自發(fā)性 動作 電位 l _ 7 ] 。細胞 的 興奮 性 依 賴 于 細胞 膜 離子 通 道 的 特性 和 靜 息 電位 的水 平l _ 8 ] 。GHRH 和 S S都 顯著 影

24、響靜息 電位 。S S誘 導(dǎo) 神 經(jīng)元 和 生 長 激 素 細胞 的超 極 化 。超 極 化 抑 制 或關(guān) 閉 電 壓 門控 型 鈣 通 道 ， 阻止 動作 電位 的產(chǎn)生 ， 最終 抑 制 GH 的分泌 。GHRH 誘導(dǎo) 顯著 的去 極 化 ， 引發(fā) 動 作 電位 。 。 。。GHS ， 如 GHR P 一 2和 GHR P 一 6對 大 鼠和羊 生長 激素 細胞 膜 電位 也有 刺 激作用 口] 。GH3細胞 表 達 GHS - R

25、和 多 種種 離 子 通 道 ， 包 括 電壓 門 控 型 鉀 離 子 通 道 和 鈣 離 子 通 道[ 4。我 們 發(fā) 現(xiàn) ， g h r e l i n可 以快 速 和 顯著 地 降 低 GH3細 胞 膜 電位 ，說 明 g h r e l i n對 GH3細 胞 的膜 電位 有 去 極 化 作 用 ， 進 而可 以通 過 電壓 門控 型 鈣通 道 引起 鈣 離子 內(nèi)流 。這 種 變化 機制有 助 于 g h r e l i n促

26、發(fā) GH 從 生 長 激 素 細 胞 釋 放 。但 關(guān) 于 g h r e l i n如 何 降低 細胞 膜 電位 的 離 子 通 道 機 制還 有待 探討 。[ 參考 文獻 ][ 1 ] Ko j i maM，Ho s o d aH，D a t eY，e ta 1 ． Gh r e l i ni sag r o wt h - h o r mo n e —r e l e a s i n ga c y l a t e dp e p t i

27、 d ef r o m s t o ma c h [ J ] ．Na t u r e ，1 9 9 9 ，4 0 2 ： 6 5 6— — 6 6 0 ．[ 2 ] Ma l a g o nMM，L u q u eRM，Ru i z — Gu e r r e r o ，E，e ta 1 ．I n t r a c e l l u l a rs i g n a l i n gm e c ha n i s msm e d i a t i n

28、 gg h r e l i n — s t i m u l a t e dg r o wt hh o r mon er e l e a s ei ns o ma t o t r o p e s [ J ] ． E n d o c r i n o l o g y ，2 0 0 3 ， 1 4 4 ：5 3 7 2一 對照組 洗脫 圖 2 各 組 G H3細 胞 平 均 膜 電 位 比較 注 ： a ： 與 對 照組 比較 ， P( 0

29、． 0 1 。5 3 8 0．[ 3 ]Ya ma z a k iM，Ko b a y a s h iH，T a n a k aT，e ta 1 ． Gh r e l i n — i n d u c e dgr o wt hh o r mo ner e l e a s ef r o m i s o l a t e dr a ta nt e r i o rp i t u i t a r yc e l l sd e —p e n d so

30、 ni n t r a c e l l u l l a ra n de x t r a c e l l u l a rC as o u r c e s [ J ] ． JNe u r o e n —d o c r i n o 1 ，2 0 0 4，1 6：8 2 5 — 8 3 1 ．[ 4 ] Ko r b o n i t sM，B u s t i nS A，Ko j i maM，e ta 1 ．Gr o wt hh o r mo n

31、 e — r e l e as i n gp e p t i de 一 2r e du c e si n wa r dr e c t i f y i n gK+ c u r r e n t sv i aaPKA—c AMP — me d i a t e ds i g n a l l i n gp a t h w a yi no v i n es o ma t o t r o p e s [ J ] ．JC l i nEn do c r

32、i n o 1M e t a b，2 0 0 1，8 6：8 8 1 — 8 8 7 ．[ 5 ] We h r e n b e r gWB，L i n gN，B r a z e a uP，e ta 1 ．S o ma t o c r i n i n，g r o wt hh o r mo n er e l e a s i n gf a c t o r ，s t i mul a t e ss e c r e t i o no fg r o

33、 wt hh o r mo n ei na n e s t h e t i z e dr a t s [ J ] ．B i o c h e mB i o p h y sRe sC o mmu n ，19 8 2 ， 1 0 9 ：3 8 2— — 3 8 7 ．[ 6 ] Na u mo vAP ，He r r i n g t o nJ ．Ac t i o n so fg r o wt h — h o r mo n e — r e l

34、e a s i n gh o r mo n eo nr a tp i t u i t a r yc e l l s ： i n t r a c e l l u l a rc a l c i um a n di o n i cc u r —r e n t s [ J ] ．P f l u g e r sA r c h ， 1 9 9 4 ，4 2 7 ： 4 1 4 —4 2 1 ．[ 7 ] Ch e nC，I s r a e lJ M

35、，Vi n c e n tJ D ．I o n i cc u r r e n t si nt h er e g u l a t i o no fs t i mu l a t i n g ／ s e c r e t i o nc o u p l i n gi ns o ma t o t r o p h s [ A] ．I n ：Del aC r u zL F ．Re g u l a t i o no fg r o wt hh o r mo

36、 n ea n ds o ma t i cg r o wt h [ ' C ] ．E x c e r p —t aM e d i c a，Am s t e r d a m ，1 9 9 2 ．5 7— 7 9 ．[ 8 ] S i ma s k oS M．Ab a c k g r o u n ds o d i u m c o n d u c t a n c ei sn e c e s s a r yf o rs p o n t

37、 a n e o u sd e p 0 1 a r i z a t i 【 ) n si nr a tp i t u i t a r yc e l ll i n eGH3 [ J ] ．AmJPh ys i o 1 ，19 9 4，2 6 6：C7 09 — 7 1 9．[ 9 ] C h e nC， Vi n c e n tJ D，C l a r k eI J ．I o nc h a n n e l sa n ds i g n a l

38、t r a n s d u c t i o np a t h wa y si nt h er e g u l a t i o no fg r o wt hh o r mo n es e c r e t i o n[ J ] ．Tr e nEn d o c r i n o 1M e t a b o 1 ，19 9 4， 5：2 2 7 — 2 3 3 ．[ 1 0 ] C h e nC，I s r a e lJ M，Vi n c e n

39、tJ D ． E 1 e c t r 0 p h y s i 0 1 0 g i c a 1r e s p o n s e st os o ma t o s t a t i no fr a th y p o p h ys i a lc e l l si ns o ma t o t r o p h — - e n r i c h e dp r i ma — -r yc u l t u r e s [ J ] ．JP h y s i o l

40、 ，1 9 8 9 ， 4 0 8 ： 4 9 3 —5 1 0 ．[ 1 l i Ch e nC，Cl a r k eI J ．Ef f e c t so fg r o wt hh o r mo n e — r e l e a s i n gp e p t i d e 一 2( GH RP一 2 1o nme mb r a n eCa 0p e r me a b i l i t yi nc u l t u r e do v i n e

41、s o ma —t o t r o p h s [ J ] ．J ． Ne u r o e n d o c r i n o l ， 1 9 9 5 ， 7 ： 1 7 9 —1 8 6 ．[ 121He r r i n g t o nJ ，Hi l l eB ．Gr o wt hh o r mo n e — r e l e a s i n gh e x a p e p t i d ee l e —v a t e si n t r a c

42、 e l l u l a rc a l c i u m i nr a ts o m a t o t r o p e sb yt wome c h a ni s ms口] ．E n d o c r i n o l o g y ，1 9 9 4 ， 1 3 5 ：1 l 0 O 一1 1 0 8 ．[ 1 3 ] Du b i n s k yJ M， Ox f o r dGS ．I o n i cc u r r e n t si nt w