基于轉(zhuǎn)錄組測序的翹嘴鱖微衛(wèi)星標記的開發(fā)及MHC classI基因的克隆表達.pdf

1、翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)隸屬于鱸形目(Perciformes)、鱖亞科(Sinipercinae)、鱖屬(Siniperca)，俗稱桂魚、桂花魚、胖鱖、季花魚等，是淡水底棲的肉食性魚類。它具有體型大、生長快、味道鮮美等特點，是我國重要的名貴經(jīng)濟魚類和養(yǎng)殖對象。但是，近年來由于江河過度捕撈、水域生態(tài)環(huán)境惡化及養(yǎng)殖生產(chǎn)中近親繁殖等原因，導致自然種質(zhì)資源衰退、養(yǎng)殖種質(zhì)性狀退化、魚類疾病不斷爆發(fā)等現(xiàn)狀，已影響到翹嘴鱖種質(zhì)延續(xù)

2、及其養(yǎng)殖業(yè)的正常發(fā)展。迫切需要運用現(xiàn)代分子生物學手段開展翹嘴鱖種質(zhì)資源保護及良種選育等方面的研究。為此，本研究采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)開發(fā)了與翹嘴鱖生長相關(guān)EST-SSR分子標記，分析了部分與經(jīng)濟性狀相關(guān)的基因位點，檢測了翹嘴鱖4個養(yǎng)殖群體（鄱陽湖、洞庭湖、太湖和長江口群體）的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性；克隆了翹嘴鱖MHC class I基因并進行了不同組織的表達分析，旨在為翹嘴鱖種質(zhì)資源保護及良種選育提供理論基礎(chǔ)，主要研究結(jié)果如下：
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3、基于翹嘴鱖轉(zhuǎn)錄組測序的EST-SSR標記開發(fā)、驗證
　　1通過Illumina高通量測序平臺對翹嘴鱖進行了轉(zhuǎn)錄組測序。組裝和轉(zhuǎn)錄組拼接后共得到51245條unigenes，在35285個(68.86％) unigenes中共檢測到14094個SSR位點，微衛(wèi)星分布頻率和密度分別是27.51%和184 per Mb。共有7335個位點被成功設計引物，其中生長、發(fā)育、增值和免疫功能二級分類條目引物共有1261對。隨機選取100對引物進

4、行多態(tài)性驗證，得到多態(tài)性引物20對。
　　2選取篩選得到的13對多態(tài)性引物對翹嘴鱖4個養(yǎng)殖群體的各30尾個體進行基因掃描，共得到262個等位基因，等位基因數(shù)從2-3不等，平均等位基因數(shù)2.15，平均有效等位基因數(shù)1.80，平均觀測雜合度0.52，平均期望雜合度0.43，平均多態(tài)信息含量0.34，達到中度多態(tài)水平（0.25洞庭湖群體>長江口群體>鄱陽湖群體。
　　3對翹

5、嘴鱖4個群體間遺傳相似度和遺傳距離的檢測結(jié)果表明，鄱陽湖和長江口群體之間遺傳距離最大（0.1302），遺傳相似性系數(shù)最小（0.8757），說明兩者親緣關(guān)系較遠；鄱陽湖和洞庭湖群體遺傳距離最?。?.0562），遺傳相似性系數(shù)最大（0.9453），說明兩者親緣關(guān)系較近。采用UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹表明，洞庭湖和鄱陽湖群體先聚為一支，然后與太湖群體聚合，最后與長江口群體聚合。
　　2基于EST-SSR標記的翹嘴鱖生長性狀相關(guān)分析

6、>　　采用翹嘴鱖轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)的13對多態(tài)性EST-SSR引物，對60尾翹嘴鱖的體長、體高、體厚及體重4種生長性狀進行標記-性狀相關(guān)性研究，結(jié)果表明：13個微衛(wèi)星位點中有5個位點與翹嘴鱖生長性狀顯著相關(guān)，C10127位點與體長顯著相關(guān)（P<0.05），與體厚極顯著相關(guān)（P<0.01），AA型是體長、體厚的優(yōu)勢基因型，AC型是劣勢基因型；C19016位點與體重顯著相關(guān)（P<0.05），AB型是體長的優(yōu)勢基因型；C14847位點與體長極顯著

7、相關(guān)（P<0.01），與體高、體厚、體重顯著相關(guān)（P<0.05），BB型是體厚的優(yōu)勢基因型； C12350位點與體長極顯著相關(guān)（P<0.01），與體重顯著相關(guān)（P<0.05），BC型是體長，體高、體厚和體重4種性狀的優(yōu)勢基因型，而AC和CC是體長的劣勢基因型； C18691位點與體高顯著相關(guān)（P<0.05），與體厚、體重極顯著相關(guān)（P<0.01），BB型為4種生長性狀的優(yōu)勢基因型，AA型為劣勢基因型。
　　3翹嘴鱖MHC clas

8、s I基因的克隆及表達分析
　　1根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序獲得的部分翹嘴鱖MHC class I cDNA片段設計引物，對其5’端和3’端分別進行RACE克隆，獲得翹嘴鱖MHC class I基因cDNA全長1925bp，包含74bp的5’非編碼區(qū)（5’-UTR）、1071bp的開放閱讀框，預測編碼356個氨基酸、780bp的3’非編碼區(qū)（3’-UTR），3’-UTR具有明顯的終止密碼子TAA、多聚腺苷酸加尾信號（AATAAA）和PolyA

9、尾巴。翹嘴鱖MHC class I基因編碼的蛋白屬于跨膜蛋白，存在分泌信號肽結(jié)構(gòu)。將所得MHC class I基因所對應氨基酸與幾種魚和人類MHC class I分子利用DNAMAN和MEGA軟件分別進行比對和繪制分子進化樹，經(jīng)ClustalW2進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)與細條石頜鯛（Lithognathus mormyrus）、金頭鯛（Sparus aurata）、紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）、狼鱸（Dicentrarc