基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的杉木磷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的鑒定及表達(dá)分析.pdf

1、杉木（Cunninghamia lanceolata）是我國(guó)特有的針葉速生用材樹種，其生長(zhǎng)發(fā)育受營(yíng)養(yǎng)元素磷的影響較大。由于南方酸性土壤對(duì)磷的強(qiáng)烈化學(xué)固定作用，導(dǎo)致土壤有效磷極度缺乏，杉木生長(zhǎng)受到抑制。長(zhǎng)期以來多代連栽的培育方式又加劇了杉木林地土壤磷營(yíng)養(yǎng)的缺乏，因此研究篩選磷高利用效杉木良種顯得十分迫切。雖然近年來對(duì)磷高效利用杉木進(jìn)行了大量的研究，取得了一些研究成果，但目前的研究大多集中在杉木木根系構(gòu)型、脅迫生理響應(yīng)、土壤肥力維持及林分營(yíng)

2、養(yǎng)循環(huán)等方面，主要是通過杉木生理生化過程的測(cè)定來進(jìn)行研究的。由于受全基因組和轉(zhuǎn)錄組等序列信息的限制，目前仍缺乏對(duì)杉木磷高效利用的分子機(jī)制方面的研究，特別是對(duì)杉木磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆和功能研究報(bào)道極少，對(duì)杉木感受、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)土壤磷并調(diào)控其體內(nèi)磷素分配的分子機(jī)制還不清楚。植物對(duì)土壤無機(jī)磷的吸收是主要依賴于Pht磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因來實(shí)現(xiàn)的，探討杉木磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白關(guān)鍵基因的結(jié)構(gòu)和功能，揭示杉木磷素營(yíng)養(yǎng)吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制，對(duì)于選育磷高利用效杉木良種和提

3、高杉木對(duì)土壤磷素的利用效率具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文選用導(dǎo)師課題組前期研究篩選出的磷高效利用的4、25、32號(hào)杉木無性系為試驗(yàn)材料，利用RACE和熒光定量PCR技術(shù)對(duì)杉木高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)基因ClPht1;1進(jìn)行了全長(zhǎng)克隆、亞細(xì)胞定位和低磷脅迫下的時(shí)空表達(dá)分析；使用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)建立了32號(hào)杉木無性系根、莖、葉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)轉(zhuǎn)錄組中的磷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因進(jìn)行了篩選和功能注釋；對(duì)注釋的2個(gè)杉木磷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因c200084_g1和c221441_g1

4、進(jìn)行了全長(zhǎng)克隆和低磷脅迫下的時(shí)空表達(dá)分析。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴使用RACE技術(shù)克隆獲得一個(gè)杉木磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pht1基因，命名為ClPht1;1（GenBank登錄號(hào)：KX302006）。基因序列編碼區(qū)長(zhǎng)1967bp，編碼545aa的蛋白質(zhì)，其原子組成為C2750H4198N698O751S28，分子量為59.95kDa，等電點(diǎn)為9.04，不穩(wěn)定系數(shù)為33.44，為穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為82.57，總平均親水性0.226，判斷為

5、疏水性蛋白。ClPht1;1所編碼蛋白具有Pht1基因家族的典型結(jié)構(gòu)，與日本柳杉等磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因具有高度同源性。亞細(xì)胞定位存在于細(xì)胞質(zhì)中，在高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上有點(diǎn)狀分布，可以排除在細(xì)胞核、細(xì)胞膜和葉綠體上的可能性。⑵ClPht1;1基因與PHT1家族基因表達(dá)特征相同，主要在杉木的根部表達(dá)，在葉片中的表達(dá)量較低；在不同磷利用效率的杉木家系中表達(dá)量存在較大差異，同時(shí)ClPht1;1基因的表達(dá)受低磷脅迫的誘導(dǎo)，缺磷脅迫下ClPht1;1基因表

6、達(dá)量明顯升高，恢復(fù)供磷后ClPht1;1基因表達(dá)量明顯降低，且脅迫程度越高，表達(dá)變化越顯著。⑶通過對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)過濾去雜，從杉木根、莖、葉序列中分別獲得76,829,210個(gè)、82,165,990個(gè)及77,534,078個(gè)Clean reads，重新組裝拼接后共獲得413,806個(gè)Unigenes，平均長(zhǎng)度為520bp。共有109,596個(gè)杉木Unigenes在NR數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋，75.0％的映射序列具有很強(qiáng)的同源性，17.8%的Un

7、igenes具有超過80%的相似性；基于物種分布分析，杉木Unigenes與高裸子植物北美云杉和無油樟的序列分別有7.5%和2.9%的匹配度。共有148,466個(gè)Unigenes在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋，其中727,287個(gè)預(yù)測(cè)基因至少有一個(gè)GO功能注釋信息；共有92,001個(gè)Unigenes在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中具有具體的蛋白功能定義；共有57,042個(gè)Unigenes在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中存在有意義的匹配，同時(shí)存在132個(gè)KEGG代謝通路。通過U

8、nigene數(shù)據(jù)庫(kù)的基因功能注釋，共有49個(gè)基因被確認(rèn)具有無機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)功能，其中25個(gè)基因被注釋為參與無機(jī)磷酸鹽跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)。⑷對(duì)杉木c200084_g1和c221441_g1兩條基因進(jìn)行克隆分別得到1634bp和1753bp的全長(zhǎng)序列，由386和487個(gè)氨基酸組成。蛋白理化性質(zhì)顯示兩個(gè)基因編碼蛋白分子量分別為43.49kDa和53.06 kDa，等電點(diǎn)分別為5.60和5.27，c200084_g1為不穩(wěn)定、親水性蛋白， c22144

9、1_g1為穩(wěn)定、親水性蛋白，兩個(gè)基因編碼蛋白均沒有信號(hào)肽，都不是分泌型蛋白。c200084_g1基因編碼蛋白有一個(gè)跨膜區(qū)域，二級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲Loop環(huán)所占比例最多為50.26%，c221441_g1編碼蛋白有兩個(gè)跨膜區(qū)域，二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占比最大為49.9%。杉木c200084_g1基因BLAST結(jié)果顯示與其他植物基因同源性大多在80%以上，編碼蛋白序列比對(duì)一致性為90.96%。c221441_g1基因BLAST結(jié)果同源性較低，大

10、多在40%左右，序列比對(duì)有66.33%的一致性。⑸c200084_g1基因在杉木根系表達(dá)量比較高，不同家系間根莖葉中表達(dá)量相差不大，同時(shí)其表達(dá)不受低磷脅迫誘導(dǎo)。c221441_g1基因在根中的表達(dá)量要遠(yuǎn)高于莖和葉，隨著不同家系杉木磷利用效率的增強(qiáng)表達(dá)量升高，且該基因受低磷誘導(dǎo)表達(dá)。我們推測(cè)c200084_g1和c221441_g1可能參與植物體內(nèi)有機(jī)磷化合物的代謝活動(dòng)， c200084_g1基因可能具有部分植物細(xì)胞壁中有機(jī)磷的攜帶和轉(zhuǎn)運(yùn)