武昌羅索線蟲轉(zhuǎn)錄組測序及性別分化相關(guān)基因的功能分析.pdf

1、蚊類害蟲不僅刺吸人血，更是多種疾病的傳播媒介，對人類生產(chǎn)生活造成了極大危害。武昌羅索線蟲（Romanomermis wuchangensis）寄生前期幼蟲可侵染包括庫蚊、伊蚊在內(nèi)的多種蚊類孑孓，通過吸取宿主血淋巴內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)來完成自身生長發(fā)育過程，最終從宿主體內(nèi)脫出并造成宿主因血淋巴外流而死亡，是一種具有極大生物防治潛力的線蟲資源。武昌羅索線蟲具有特殊的性別分化機制:當每宿主體內(nèi)寄生的線蟲數(shù)目較少時，每條線蟲相應獲得的營養(yǎng)物質(zhì)較多，則線

2、蟲更趨于發(fā)育成為雌蟲;而當每宿主體內(nèi)寄生的線蟲數(shù)目較多時，每條線蟲相應獲得的營養(yǎng)物質(zhì)較少，則線蟲更趨于發(fā)育成為雄蟲。然而在自然界中，武昌羅索線蟲這一具有巨大生物防治潛力的線蟲資源數(shù)量和分布范圍有限，且對其進行體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)該線蟲的性別分化過程在體外條件下難以完成，表現(xiàn)為性別相關(guān)表征發(fā)育不成熟，很大程度上限制了該線蟲資源的商品化生產(chǎn)并投入對蚊類害蟲的實際防治應用中。目前，對于武昌羅索線蟲這一生物防治材料的性別分化機制的研究相對較少，故深入研

3、究其性別分化相關(guān)基因，不僅可為揭示該線蟲的營養(yǎng)決定性別分化的分子機制提供科學數(shù)據(jù)，同時還能促進該線蟲的大量體外培養(yǎng)研究。
　　本研究通過對武昌羅索線蟲進行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選得到了Rwucmab-3、Rwuclaf-1和Rwuctra-2等三個武昌羅索線蟲的性別分化相關(guān)基因，并對這三個基因的表達模式和實際功能進行了初步的探究。通過對武昌羅索線蟲寄生期3、4、5天，寄生后期1、3、5、7天和成蟲期雌雄線蟲以及懷卵雌蟲體內(nèi)的Rwucmab

4、-3、Rwuclaf-1和Rwuctra-2三個基因的相對表達水平進行檢測發(fā)現(xiàn):(1)Rwucmab-3基因的相對表達量在寄生期3天雌雄線蟲之間已出現(xiàn)顯著性差異(p＜0.05)，早于Rwuclaf-1和Rwuctra-2基因，推測武昌羅索線蟲性別分化過程在寄生期3天已經(jīng)啟動;(2)寄生后期1天線蟲的Rwuclaf-1基因的相對表達量顯著高于其他發(fā)育時期雌雄線蟲，根據(jù)秀麗線蟲中關(guān)于laf-1基因的研究和武昌羅索線蟲寄生后期線蟲的發(fā)育特點，

5、推測Rwuclaf-1基因在此時期的高表達與線蟲的性腺及雌配子的發(fā)育成熟相關(guān);(3)寄生后期1天雌線蟲體內(nèi)Rwuctra-2基因的相對表達量顯著高于其它發(fā)育期雌線蟲，根據(jù)秀麗線蟲中關(guān)于tra-2基因的研究和武昌羅索線蟲寄生后期線蟲的發(fā)育特點，推測可能與雌線蟲的性腺發(fā)育、配子形成等過程相關(guān)。
　　為了探究Rwucmab-3基因在線蟲體內(nèi)的實際表達部位，本研究對武昌羅索線蟲的Rwucmab-3基因進行了原位雜交實驗。實驗結(jié)果顯示:Rw

6、ucmab-3基因在寄生后期雌線蟲尾部性腺卵母細胞中表達，推測Rwucmab-3基因與其在小鼠中的同源基因dmrt-1、果蠅中的同源基因dsx相同在卵母細胞內(nèi)卵黃蛋白的合成過程中發(fā)揮作用。為了進一步探究Rwucmab-3、Rwuclaf-1和Rwuctra-2基因在武昌羅索線蟲性別分化過程中發(fā)揮的具體作用，我們對以上三個基因進行了RNAi實驗，結(jié)果顯示:(1)Rwucmab-3 dsRNA浸泡組線蟲相較于gfp dsRNA浸泡組和空白對

7、照組其雌雄性比極顯著提高(p＜0.01)，達到0.35±0.02;(2) Rwuclaf-1 dsRNA浸泡組和Rwuctra-2dsRNA浸泡組線蟲相較于gfp dsRNA浸泡組和空白對照組其雌雄性比雖略有上升和下降，但其差異未達到顯著水平（p＞0.05），推測可能與性別分化過程中基因互作復雜以及所選取目的基因dsRNA的位置和長度不合適相關(guān)。
　　綜上所述，本研究首次對武昌羅索線蟲進行了轉(zhuǎn)錄組測序并對測序所得數(shù)據(jù)進行了分析，為