小麥春化響應轉(zhuǎn)錄組及相關基因功能分析.pdf

1、春化是小麥生長發(fā)育過程中重要的調(diào)控環(huán)節(jié)，通過低溫春化過程可以有效調(diào)控小麥幼穗的發(fā)育及分化進程，進而直接影響到小麥的抗凍能力和籽粒產(chǎn)量與品質(zhì)。因此，開展小麥春化分子調(diào)控機制的研究對于小麥抗凍和高產(chǎn)分子育種研究均具有重要意義。本研究在前期研究的基礎上，利用Illumina高通量測序技術，系統(tǒng)分析了小麥對春化響應的轉(zhuǎn)錄組及其在春化過程中的差異表達譜，并對與春化調(diào)控密切相關的候選基因進行了初步的功能鑒定，主要研究結(jié)果如下：
　　1、春化響

2、應的轉(zhuǎn)錄組及差異表達譜分析
　　以春性品種遼春10號和冬性品種京841作為試驗材料，利用Illumina高通量第二代測序技術進行了深度測序分析，得到了69,751,192 raw reads和5,787,106,380(5.78Gb)核苷酸?；谛蛄型葱?，138,062個序列分為61個功能集合，56,868個組裝序列歸屬于25個COG聚類。從遼春10號和京841春化、未春化幼芽，春化、未春化二棱期的樣品中構(gòu)建了8個DGEs，獲得

3、了一批差異表達的基因。利用qRT-PCR技術，對部分差異表達基因的表達模式進行了驗證分析，包括9個轉(zhuǎn)錄因子、7個甲基化相關基因、2個開花調(diào)控相關基因、2個春化相關基因、1個低溫響應基因、1個脫水素基因、1個冰晶重結(jié)晶抑制蛋白和1個ABA相關基因。表達特性分析顯示，qRT-PCR的分析結(jié)果與DGE獲得的表達模式相一致，進一步證實通過高通量技術獲得的基因差異表達數(shù)據(jù)真實可靠。
　　2、春化響應候選基因的篩選及其時空表達模式分析

4、　　通過對J-NV&J-V和LC-NV&LC-V的比較，得到京841特異表達基因29498個，根據(jù)功能注釋，篩選出8類共計639個與春化響應相關的候選基因；分別從這8類中挑選差異倍數(shù)較高的基因，共計17個，對其在春化過程中的的表達模式進行了分析，包括6個轉(zhuǎn)錄因子、3個甲基化相關基因、2個開花調(diào)控相關基因、2個春化相關基因、1個低溫響應基因、1個脫水素基因、1個冰晶重結(jié)晶抑制蛋白和1個ABA相關基因。從這17個基因中挑選下調(diào)差異倍數(shù)10倍

5、以上且長度大于1000bp的基因，共計6個，分別是CL8746.Contig1（TF：B-box transcription factor）、CL18846.Contig2（TF：zinc finger protein）、Unigene10196（TF）、CL12788.Contig3（TF：zinc finger protein）、CL14010.Contig2（vernalization）、Unigene16777（methylat

6、ion），另從J-NV&J-V的差異基因中挑選出1個差異倍數(shù)10倍以上，長度超過1000bp的基因CL176.Contig1（CDT1-like protein）在京841中進行cDNA克隆及序列分析。篩選的7個基因涉及信號轉(zhuǎn)導、細胞生長周期、衰老及防御相關、DNA甲基化和有絲分裂，這些過程可能與春化響應有密切的聯(lián)系。對7個基因在春化過程中的動態(tài)表達模式進行了分析，7個基因總體表達趨勢均為下調(diào)，但CL8746.Contig1在春化第6天

7、上調(diào)表達，隨后下調(diào)；Unigene16777和CL176.Contig1表現(xiàn)出波動下調(diào)；其余基因均表現(xiàn)出持續(xù)下調(diào)。上述研究結(jié)果顯示，這些候選基因在春化響應過程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能，可能涉及到多個不同的基因表達調(diào)控途徑。
　　3、重點候選基因的功能鑒定
　　利用病毒誘導的基因沉默（VIGS）技術，以大麥條紋花葉病毒（BMSV）為載體，建立了以京841為實驗材料的小麥VIGS基因功能鑒定技術體系。在此基礎上，對春化響應的7個候選

8、基因的功能進行了驗證分析。結(jié)果顯示，本研究中構(gòu)建的BSMV重組載體侵染小麥葉片后，對植株的幼穗發(fā)育進程有不同程度的影響?？瞻?、陽性和陰性對照之間差異不顯著，但與目的基因相比表現(xiàn)出顯著的差異?？瞻讓φ諒某雒绲蕉馄谛枰?5.0天，而BSMV重組載體接種的植株最長僅需66.5天，最短為59.8天，大大縮短了出苗到二棱期的生育進程。上述研究顯示，7個候選基因在小麥開花調(diào)控過程中具有開花抑制效應，關于其在小麥春化過程中的具體生物學功能仍有待進一

9、步研究。
　　4、春化基因VRN1和VER2的克隆及表達特性分析
　　VRN1和VER2是已知的春化基因，本研究中篩選的兩個基因CL19305.Contig2和CL14010.Contig2分別與VRN1和VER2100％相似。本研究以8個不同發(fā)育特性小麥品種cDNA為模板，克隆VRN-A1和VER2基因的完整ORF，并分析其序列特性，結(jié)果表明，這兩個基因在8個品種中的序列高度相似。利用qRT-PCR進行春化過程中動態(tài)表達模

10、式的分析，冬性品種VRN1基因在春化前期表達量極低，隨著春化時間延長呈波動上調(diào)的趨勢，且VRN1表達水平上調(diào)所需的時間與小麥品種不同類型所需的春化時間相一致，可能正是VRN1表達水平上調(diào)促進了冬性品種發(fā)育進程的加快，得以正常抽穗開花。而在春性品種中，VRN1在春化起始階段開始表達，隨著春化時間的延長波動上調(diào)。VER2基因在8個品種春化過程中的表達模式差異較大。春性品種中受到春化作用的誘導波動上調(diào)表達，而在冬性品種中，被春化作用所抑制波動