小麥春化相關(guān)基因TaVRN2和NF-Y家族基因TaNF-YB3的分離與功能分析.pdf

1、開花是植物生長發(fā)育的核心過程，小麥（Triticum aestivum L.）作為一種重要的糧食作物，其開花時(shí)間主要受春化作用途徑和光周期途徑兩方面的調(diào)節(jié)。為了理解小麥開花時(shí)間的分子調(diào)控機(jī)制，本研究分離了小麥開花時(shí)間基因TaVRN2，光周期基因CO（WCO1和TaHd1）以及NF-Y（HAP）家族基因，從序列分析和蛋白互作方面研究了它們之間的關(guān)系；并對小麥TaVRN2和TaNF-YB3基因的表達(dá)模式與生物學(xué)功能進(jìn)行了深入研究。主要結(jié)果如

2、下：
　　 1．TaVRN2基因的序列特征
　　 小麥VRN2基因位點(diǎn)含有ZCCT1和ZCCT2兩個基因，我們從六倍體小麥煙農(nóng)15分離到ZCCT-A1、ZCCT-B1、ZCCT-D1、ZCCT-A2和ZCCT-D2基因，分別含有一個長度為621bp、642bp、639bp、639bp和639bp的開放閱讀框，對應(yīng)地編碼206、213、212、212和212個氨基酸殘基組成的蛋白。這些蛋白均含有一個鋅指結(jié)構(gòu)和一個典型的由4

3、3個氨基酸組成的CCT-domain區(qū)域，VRN2蛋白在CCT-domain發(fā)生了一定的點(diǎn)突變，如ZCCT-A1的R39C，ZCCT-A2的R/K16C。氨基酸序列比較分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明TaVRN2蛋白與其他植物中的同系物高度同源，與單子葉植物的大麥HvZCCT-Ha和HvZCCT-Hb的親緣關(guān)系較近，其次是大麥的CO-like蛋白HvCO9，而與雙子葉植物擬南芥的CO-like蛋白親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，并且擬南芥中沒有VRN2的同源

4、蛋白。
　　 2．小麥CO基因和NF-Y家族基因的序列分析
　　 分離了六倍體小麥CO的2個候選基因WCO1和TaHd1的編碼區(qū)全長序列，得到WCO1-2、WCO1-13和WCO1-16三個不同的克隆，以及一個TaHd1-3基因；同時(shí)還分離到小麥NF-Y家族的12個基因，即NF-YA的1、3、5、7和NF-YA9的2個不同克?。∟F-YA9-8和NF-YA9-13）基因，NF-YB的3、4、8和11四個基因，NF-YC的

5、6、7和14三個基因。獲得的這些小麥CCT-domain相關(guān)蛋白以及擬南芥AtCO蛋白的CCT-domain區(qū)域，與NF-YA蛋白亞族的核心區(qū)域進(jìn)行氨基酸序列對比，結(jié)果表明CCT-domain在這些CCT-domain蛋白中高度保守，并與NF-YA蛋白的核心序列相對保守。NF-YA蛋白包括一個NF-YB/YC結(jié)合區(qū)、一個接頭序列（Linker）和一個DNA結(jié)合區(qū)，在各物種間保守；NF-YB和NF-YC蛋白的核心區(qū)也含有與其他亞基互作和D

6、NA結(jié)合所必需的區(qū)域，NF-YB亞族彼此間相對保守，但是NF-YC間的相似性則很低。而且TaNF-YB3基因還響應(yīng)不同的非生物脅迫，低溫與春化作用相似，均抑制其表達(dá)。在LD，TaNF-YB3的表達(dá)水平高于SD，但LD中給予一段時(shí)間的SD，表達(dá)驟然上升，這與LD下插入一段SD、4℃春化處理的結(jié)果類似，因?yàn)椴迦氲腟D和春化期間的表達(dá)趨勢相近，這說明TaNF-YB3基因優(yōu)先響應(yīng)LD。TaNF-YB3基因在冬性小麥LD、SD的節(jié)奏性表達(dá)間接證實(shí)

7、了酵母雙雜交的結(jié)果，因?yàn)槠錈o論LD還是SD條件都與小麥TaVRN2的表達(dá)模式一致，尤其是與ZCCT1的更相近，但與CO的模式不一致，這能在生物節(jié)律鐘的同步性上說明二者互做的可能性。
　　 3．小麥TaVRN2、CO與NF-Y的互作關(guān)系
　　 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)初步檢測了獲得的小麥CCT-domain類蛋白與NF-YB和NF-YC的互作情況，但仍需要進(jìn)一步證實(shí)。
　　 4．TaVRN2基因的表達(dá)分析
　　 實(shí)時(shí)

8、定量RT-PCR檢測了TaVRN2基因的部位表達(dá)模式，結(jié)果表明其主要在早期營養(yǎng)生長的葉片中表達(dá)，其他器官和生殖生長階段表達(dá)很低或不表達(dá)，而且研究也揭示ZCCT1基因的表達(dá)水平在同等條件下均較高于ZCCT2基因。同時(shí)，定量RT-PCR的結(jié)果也揭示小麥ZCCT1和ZCCT2在LD和SD條件都呈現(xiàn)節(jié)奏性表達(dá)，并且在光結(jié)束時(shí)達(dá)到表達(dá)高峰，而且ZCCT1一般比ZCCT2提前2h到達(dá)峰值。這說明TaVRN2受日照長度和生物鐘的調(diào)控。
　　

9、5．TaVRN2基因的生物學(xué)功能分析
　　 除了對TaVRN2基因的序列和表達(dá)特性進(jìn)行分析外，我們還對該基因的生物學(xué)功能進(jìn)行了深入的分析。Ubi::ZCCT-A1轉(zhuǎn)基因二穗短柄草Bd21，在LD條件推遲開花，強(qiáng)表型的開花時(shí)間大于1.5個生長周期的，野生型6-7片葉開花，強(qiáng)晚花表型13片葉仍處于營養(yǎng)生長。但是，給予4周的春化處理，可以打破晚花表型，使開花時(shí)間較野生型晚5天左右，而給予6周的春化處理則達(dá)到飽和點(diǎn)，與野生型開花時(shí)間完全

10、一致。而且，轉(zhuǎn)基因植株中，春化相關(guān)基因VRN1的表達(dá)水平明顯下降，VRN3的也降低，但VRT2-like基因的表達(dá)水平呈上升狀態(tài)。這表明ZCCT-A1的過量表達(dá)導(dǎo)致晚花與其他春化基因的表達(dá)水平變化有關(guān)聯(lián)。
　　 6．小麥TaNF-YB3基因的序列分析
　　 小麥TaNF-YB3基因近全長cDNA含有809個核苷酸，編碼199個氨基酸?；蚪M定位結(jié)果顯示此基因位于D基因組的3號染色體。與水稻、擬南芥、人類和酵母的HAP3的

11、同源性分析揭示，TaNF-YB3與水稻OsHAP3I的同源性最高，達(dá)85％，和擬南芥AtNF-YB3也具有較高的同源性（65％）。但與酵母和人類的較低，分別為50％和47％。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明其屬于不參與胚胎形成的non-LEC1-like分支，與水稻OsHAP3F和OsHAP3I的親緣關(guān)系較近。
　　 7．TaNF-YB3基因的表達(dá)分析
　　 利用實(shí)時(shí)定量RT-RCR技術(shù)檢測TaNF-YB3基因的表達(dá)模式，分析結(jié)果顯示

12、，其mRNA主要積累在葉片中，莖中的表達(dá)水平一般，幾乎不在根中表達(dá)；在幼穗、雌蕊和幼胚的表達(dá)水平很低。但在雄蕊中表現(xiàn)出較高水平的表達(dá)，而且與莖中的積累幾乎相同。而且TaNF-YB3基因還響應(yīng)不同的非生物脅迫，低溫與春化作用相似，均抑制其表達(dá)。在LD，TaNF-YB3的表達(dá)水平高于SD，但LD中給予一段時(shí)間的SD，表達(dá)驟然上升，這與LD下插入一段SD、4℃春化處理的結(jié)果類似，因?yàn)椴迦氲腟D和春化期間的表達(dá)趨勢相近，這說明TaNF-YB3基

13、因優(yōu)先響應(yīng)LD。TaNF-YB3基因在冬性小麥LD、SD的節(jié)奏性表達(dá)間接證實(shí)了酵母雙雜交的結(jié)果，因?yàn)槠錈o論LD還是SD條件都與小麥TaVRN2的表達(dá)模式一致，尤其是與ZCCT1的更相近，但與CO的模式不一致，這能在生物節(jié)律鐘的同步性上說明二者互做的可能性。
　　 8．TaNF-YB3基因的過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥在開花時(shí)間上無明顯影響
　　 35S::TaNF-YB3轉(zhuǎn)擬南芥植株在開花時(shí)間上與野生型差異不大，但轉(zhuǎn)基因葉片出現(xiàn)