外周循環(huán)血微小RNA表達水平與冠心病發(fā)病風險的關聯(lián)分析.pdf

1、研究背景：
　　缺血性心臟病（ischemic heart disease，IHD），又稱冠心病（coronary heart disease， CHD），已經(jīng)成為人群死亡的最主要病因。多年的臨床與基礎相關研究證實，冠心病是一種免疫、環(huán)境與遺傳等多因素交互作用的炎癥性疾病，血流動力學變化、感染、應激、炎癥反應等因素都可加重其病程。由于冠心病發(fā)生的危險因素及發(fā)病機制相對比較復雜，具有種族差異和遺傳異質(zhì)性等因素，因此，為了對冠心病進行

2、早期診斷以及早期預防，對其內(nèi)在發(fā)病機制以及相互影響的研究一直鍥而不舍地進行著。期望通過研究找到能夠更好的阻止該病的發(fā)展的重要因素，使得患者的治愈率和生存率得到提高。
　　以往研究發(fā)現(xiàn)外周循環(huán)血中存在多種微小RNA（MicroRNAs，miRNAs），且與動脈粥樣硬化、冠心病等疾病密切相關。
　　miRNAs是一類高度保守的內(nèi)源性小分子單鏈非編碼RNA，約含20～24個寡核苷酸，結構以及物種保守性非常高，無論是時序性還是組織特

3、異性都很嚴格，因此，幾乎存在于所有的真核微生物中。miRNAs通常靶向一個或多個 mRNA，通過與特定靶基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)（3’-untranslated region，3’-UTR）互補性結合對其降解或抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，存在于外周循環(huán)血中的miRNAs，作為一種調(diào)節(jié)因子，在血管發(fā)育、血管再生或心臟發(fā)育的過程中發(fā)揮重要作用。目前，已發(fā)現(xiàn)大約800種的miRNAs，超過1000種mi RN

4、As能夠在人類基因組進行表達。有研究提示 miRNAs可能與心臟病的治療與預防相關，可作為一種新型的生物標記物，有望成為冠心病治療的一個新的治療靶點。目前發(fā)現(xiàn)與冠心病相關的miRNAs很多，其中研究較多的有 miR-1、miR-126、miR-133、miR-208和 miR-499等，這些 miRNAs在冠心病患者表達水平異常，提示它們可能是冠心病的潛在生物標志物，但尚未得出一致結論。并且，此類 miRNAs在外周循環(huán)血中的表達水平與

5、冠心病患者冠狀動脈病變狹窄程度是否具有相關性尚不清楚。
　　本研究旨在探討外周循環(huán)血中 miR-133a、miR-208a和 miR-499a是否能夠在冠心病患者中進行表達，同時探討其與冠狀動脈狹窄程度之間的關系，分析外周循環(huán)血中的miR-133a、miR-208a和 miR-499a在冠心病發(fā)病中的臨床預示作用，為進一步探討冠心病的基因診斷和治療提供重要的理論依據(jù)。
　　目的：
　　1.分析冠心病患者血漿 miRNA

6、-133a、miRNA-208a和 miRNA-499a表達水平與對照組之間的差異。
　　2.分析所有研究病例血漿 miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a表達水平與冠狀動脈病變狹窄程度的相關性，探討其在早期診斷和預防冠心病的臨床應用價值。
　　方法：
　　1.獲得第四軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，取得患者及家屬知情同意后，選取2014年12月至2015年5月于第四軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)

7、科住院并行冠狀動脈造影（coronary angiography，CAG）明確診斷為冠心病患者290例作為病例組，年齡30～85周歲，他們之間無血緣關系，冠脈三支主要血管中，至少有一支狹窄程度超過50％。同時選取基線資料配對的110例疑診冠心病患者，行CAG后，冠狀動脈三支主要血管的狹窄程度均小于50%，能夠明確排除冠心病，作為對照組。記錄所有研究對象的完整病史信息和收集所有研究對象采血所檢測的生化檢查的臨床資料。
　　2.Gen

8、si ni評分是評價冠狀動脈病變嚴重程度的經(jīng)典評分方法，對400例入選對象按照四分位數(shù)間距分為四組：A組99例，Gensini評分≤22分，B組98例，Gensini評分23～55分，C組102例，Gensini評分56～96分，D組101例，Gensini評分≥97分。
　　3.所有研究對象的冠狀動脈造影均采用橈動脈或股動脈途徑進行。在行冠狀動脈造影術前抽取橈動脈或股動脈血5ml于含EDTA抗凝劑采血管中，兩次離心后取上清液，分

9、裝到EP管儲存于-80℃冰箱中備用。
　　4.miRNA檢測：將離心得到的血漿取500μl到新的離心管中，用 RNAiso Plus（TaKaRa，Code No.9109），根據(jù)試劑操作說明對樣本的總RNA進行提取，放在-80℃低溫冰箱中保存，進行逆轉(zhuǎn)錄。各樣本均取樣20ng，總RNA應用PrimeScriptTM RT Master Mix（TaKaRa，Code No.RR036A），配制成10μl體系的逆轉(zhuǎn)錄（revers

10、e transcription，RT）反應液進行逆轉(zhuǎn)錄，得到 cDNA。以 RNU6B為內(nèi)參。各樣本逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物均取2μl應用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa，Code No.RR820A），配制成25μl體系的PCR反應液，通過使用ABI7500儀以及對TaqMan探針的應用，對定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）進行

11、實時定量，通過PCR雙重特異性引物擴增技術，對miR-133a、miR-208a和miR-499a的Ct值進行檢測。內(nèi)參為RNU6B。
　　5.統(tǒng)計學分析：采用統(tǒng)計學分析軟件 SPSS19.0計算各樣本的△Ct值（目的基因Ct值-內(nèi)參基因 Ct值），各樣本的相對定量2-△Ct。以均數(shù)±標準差（(x)±s）方法處理正態(tài)分布的臨床基線資料數(shù)據(jù)及實驗數(shù)據(jù)，采取Mann-Whitney U檢驗方法對偏態(tài)分布的兩組數(shù)據(jù)進行差異比較，通過頻數(shù)

12、以及百分數(shù)表述分類資料。采取獨立樣本 t檢驗比較兩組miRNA表達水平，采取卡方檢驗對多組間進行比較，采取Pearson相關分析對兩個變量之間的相關性進行比較。以P＜0.05表示具有顯著的統(tǒng)計學差異。
　　結果：
　　1.與對照組比較，病例組吸煙患者比例更高，高密度脂蛋白水平更低，存在顯著差異（P＜0.05）。但其他因素如年齡、性別、體重、體重指數(shù)（BMI）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、空腹血糖、高血壓病史、低密度脂

13、蛋白（LDL）、糖尿病史、肌酐、尿酸水平無顯著差異（P＞0.05）。
　　2.根據(jù)Gensi ni評分按照四分位數(shù)間距分為四組，統(tǒng)計分析結果表明，各組甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）水平均存在顯著差異（P＜0.05）。而年齡、性別、體重、體重指數(shù)（BMI）、高血壓病史、糖尿病史、吸煙史、空腹血糖、高密度脂蛋白（LDL）、肌酐、尿酸水平無顯著差異（P＞0.05）。
　　3.實時熒光定量 PCR相對定量

14、檢測 miRNA結果：與對照組比較，病例組miRNA-133a、miRNA-208a和 miRNA-499a表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　4.根據(jù)Gensi ni評分按照四分位數(shù)間距分為四組，統(tǒng)計分析結果表明，各組之間miRNA-133a、miRNA-208a和miRNA-499a表達水平差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且表達水平變化與冠狀動脈狹窄程度即Gensini評分呈正相關關系。
　　結