微小RNA對冠心病患者ABCG1甲基化影響的研究.pdf

1、背景與目的：冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，也稱作冠心病，是最常見的心血管疾病之一。最近越來越多的研究表明，各種冠心病相關基因的異常甲基化與冠心病的發(fā)生發(fā)展有著一定的關系。同樣有許多研究發(fā)現(xiàn)，微小 RNA（microRNA，miRNA）可以通過抑制靶基因的表達來發(fā)揮其生物學功能，因此其功能紊亂與冠心病也有著密切的關系。我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn) miR-30b在冠心病患者中是低表達的，且通過生物信息學網(wǎng)站預測到 miR-30b能與 DNA甲基化轉(zhuǎn)

2、移酶3A（DNA methyltransferases3A，DNMT3A）的3’端非翻譯區(qū)（3’ untranslated region，3’UTR）特異性結合。同時我們也發(fā)現(xiàn)一個冠心病相關基因，三磷酸腺苷結合盒轉(zhuǎn)運子 G1（ATP-binding cassette G1，ABCG1）的啟動子區(qū)甲基化水平在冠心病患者中是升高的，因此本研究意在探求 miR-30b在巨噬細胞中能否通過改變 DNMT3A蛋白水平而影響 ABCG1甲基化水平。

3、
　　方法：(1)運用生物信息學網(wǎng)站預測 DNMT3A是否是 miR-30b靶基因。同時構建含有 DNMT3A（3’UTR）的雙熒光素酶報告載體，將其與 miR-30b模擬物共轉(zhuǎn)染至 Hela細胞，運用雙熒光素酶報告載體技術驗證 miR-30b能否與DNMT3A（3’UTR）特異性結合。(2)將 miR-30b模擬物轉(zhuǎn)染至 THP-1源性巨噬細胞，運用實時定量熒光 PCR技術檢測 DNMT3A的mRNA水平，運用 western

4、blot技術檢測 DNMT3A蛋白表達水平。(3)將 miR-30b轉(zhuǎn)染至 THP-1源性巨噬細胞和原代培養(yǎng)人外周血巨噬細胞，運用焦磷酸測序技術檢測 miR-30b能否在巨噬細胞中影響 ABCG1甲基化水平。
　　結果:(1)經(jīng)過生物信息學網(wǎng)站預測，DNMT3A（3’UTR）上存在 miR-30b特異性結合靶點；通過雙熒光素酶報告載體技術檢測發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，miR-30b能降低 pmirGLO-DNMT3A載體上的螢火蟲熒

5、光素酶活性(p＜0.05)。(2)實時熒光定量 PCR檢測表明，miR-30b在巨噬細胞中不能降低DNMT3A的mRNA水平；western blot技術發(fā)現(xiàn)，miR-30b可以通過抑制DNMT3A的mRNA翻譯的方式來阻遏 DNMT3A的蛋白質(zhì)合成(p＜0.05)。(3)焦磷酸測序發(fā)現(xiàn)在 THP-1源性巨噬細胞和人外周血巨噬細胞中，miR-30b均未影響 ABCG1的甲基化水平。
　　結論:miR-30b可以與 DNMT3A（3