β-catenin蛋白調(diào)節(jié)機(jī)制的研究.pdf

1、為了進(jìn)一步深入研究β-catenin的調(diào)節(jié)機(jī)制,并闡述其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,該研究中,我們選擇兩個(gè)基因作為主要研究對(duì)象:(1)通過對(duì)人FRAT1基因功能和與食管癌關(guān)系的研究,探討β-catenin蛋白在食管癌中異常累積的機(jī)制;(2)以PCP-2基因?yàn)檠芯繉?duì)象,探討酪氨酸磷酸酶對(duì)β-catenin蛋白功能的負(fù)調(diào)節(jié)作用.首先,我們構(gòu)建了人FRAT1基因的原核和真核表達(dá)載體,并使其攜帶外源標(biāo)簽HA.經(jīng)DNA測序,與GeneBank中比較,

2、證明序列基本一致.FRAT1基因在原核系統(tǒng)中不能誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白,這也是Wnt通路其它成員中的常見問題.而FRAT1的真核表達(dá)載體能夠在293細(xì)胞中正確表達(dá),利用抗外源標(biāo)簽HA的抗體進(jìn)行檢測,在預(yù)期的位置有特異性的條帶.經(jīng)G418篩選,獲得穩(wěn)定細(xì)胞株293/FRAT1,為今后的功能研究提供了良好的細(xì)胞模型.進(jìn)一步探討FRAT1促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制,結(jié)果表明,FRAT1能夠促進(jìn)β-catenin蛋白在細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)的累積,同時(shí)使細(xì)胞內(nèi)

3、游離狀態(tài)的β-catenin蛋白水平提高.報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示,FRAT1的過表達(dá)可以激活β-catenin/TCF依賴的轉(zhuǎn)錄.Western Blot結(jié)果表明,FRAT1可以引起Wnt/β-catenin通路的靶基因c-myc、survivin、cox-2和Id2的上調(diào),而且上調(diào)依賴于β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性.為了探討酪氨酸磷酸酶對(duì)β-catenin的負(fù)調(diào)節(jié)作用,我們選擇受體型酪氨酸磷酸酶PCP-2作為研究對(duì)象.首先通過免疫共沉淀的方

4、法,證明PCP-2通過其胞內(nèi)區(qū)(近膜區(qū)和兩個(gè)磷酸酶活性區(qū))與β-catenin蛋白相互作用.經(jīng)典的Top/Fop Flash報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示,PCP-2的全長和PCP-2胞內(nèi)區(qū)對(duì)于野生型和突變型β-catenin引起的轉(zhuǎn)錄激活均具有抑制作用,并且還可以抑制β-catenin/TCF激活的靶基因的蛋白表達(dá).將PCP-2的兩個(gè)磷酸酶活性區(qū)突變后,這種抑制作用就消失了,提示PCP-2對(duì)β-catenin蛋白轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)可能依賴于酪氨酸磷酸酶

5、活性,通過影響β-catenin蛋白的酪氨酸磷酸化水平發(fā)揮作用.綜上所述,該實(shí)驗(yàn)從兩個(gè)方面探討了β-catenin的調(diào)節(jié)機(jī)制.FRAT1是已知的Wnt通路的正調(diào)節(jié)因子,但是尚無直接結(jié)果表明FRAT1對(duì)β-catenin蛋白的調(diào)節(jié),以及FRAT1在腫瘤中的作用機(jī)制.該實(shí)驗(yàn)首次在細(xì)胞水平上證明了FRAT1對(duì)β-catenin蛋白水平和功能具有正向調(diào)節(jié)作用,同時(shí)首次提出FRAT1的上調(diào)可能是食管鱗癌中β-catenin蛋白異常累積的原因之一,