哈茨木霉銅脅迫應(yīng)答相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因thmea1功能研究.pdf

1、木霉菌（Trtchoderma）作為生物活體制劑農(nóng)藥和肥料的有效成分，在植物病害生物防治、土壤環(huán)境改良方面有巨大的應(yīng)用潛力。近年來(lái)由于銅及含銅化合物被廣泛應(yīng)用于殺菌劑、化學(xué)殺蟲(chóng)劑及畜牧食品添加劑等，致使土壤銅含量不斷增加，對(duì)土壤微生物造成不良影響，引起土壤生態(tài)系統(tǒng)失衡和土壤質(zhì)量下降。研究木霉菌銅耐受及代謝相關(guān)機(jī)制，對(duì)提高防病效果、改善土壤生態(tài)環(huán)境等具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，生防菌哈茨木霉（T harzianum）Th33中存在

2、一種C2H2型轉(zhuǎn)錄因子，命名為thmea1，該基因在銅脅迫下發(fā)生差異表達(dá)，其編碼的蛋白序列中存在3個(gè)與酵母金屬硫蛋白表達(dá)激活因子ACE2保守的C2H2結(jié)構(gòu)域，推測(cè)該基因可能參與哈茨木霉菌的銅脅迫應(yīng)答及代謝過(guò)程。為進(jìn)一步研究其功能，本研究采用基因敲除和過(guò)表達(dá)技術(shù)，結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，探究了thmea1基因的功能，結(jié)果如下:
　　1、參照哈茨木霉Th33基因組信息，設(shè)計(jì)特異性引物，以Th33菌株cDNA為模板，PC

3、R擴(kuò)增獲得thmea1基因編碼區(qū)序列。測(cè)序結(jié)果顯示，該基因全長(zhǎng)1446bp，無(wú)內(nèi)含子，擁有1個(gè)外顯子，編碼蛋白序列與酵母金屬硫蛋白表達(dá)激活因子ACE2及其同源蛋白SWI5存在3個(gè)較為保守的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，推測(cè)thmea1為C2H2型轉(zhuǎn)錄因子基因，序列提交NCBI獲得GenBank登錄號(hào)為MF802279。
　　2、采用同源敲除原理構(gòu)建獲得thmea1基因敲除載體pKH-KO-△thmea1，采用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，將敲

4、除載體轉(zhuǎn)入哈茨木霉Th33原生質(zhì)體，篩選獲得thmea1基因敲除突變株△thmea1。以構(gòu)巢曲霉gpdA和trpC為啟動(dòng)子和終止子構(gòu)建獲得thmea1基因過(guò)表達(dá)載體pKH-KO-Othmea1，采用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，將過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入Th33原生質(zhì)體，篩選獲得thmea1基因過(guò)表達(dá)突變株Othmea1。
　　3、對(duì)野生菌Th33、敲除突變株△thmea1和過(guò)表達(dá)突變株Othmea1的銅離子耐受實(shí)驗(yàn)顯示，在0～24mM/L銅

5、離子濃度下，△thmea1的生長(zhǎng)速度顯著快于Th33和Othmea1，氣生菌絲量略多，且銅離子耐受中濃度(MIC50)為192mM/L，較Th33(MIC50170mM/L)和Othmea1(MIC50174mM/L)提高了約129％。銅離子吸附實(shí)驗(yàn)顯示，野生菌和突變株對(duì)銅離子的吸附率無(wú)顯著差異。綜上表明thmea1基因的缺失提高了哈茨木霉對(duì)銅離子的耐受性。
　　4、銅代謝相關(guān)基因的qRT-PCR分析顯示，銅脅迫下，△thmea1

6、中的金屬硫蛋白基因(Tha07074)表達(dá)水平顯著高于Th33和Othmea1，表達(dá)量約為T(mén)h33的5倍，推測(cè)thmea1基因負(fù)調(diào)控金屬硫蛋白基因的表達(dá)。P型-ATP酶基因(Tha_08191)在Th33和Othmea1中的表達(dá)水平顯著高于△thmea1，該轉(zhuǎn)運(yùn)酶能夠協(xié)助細(xì)胞內(nèi)銅離子進(jìn)入高爾基體分泌系統(tǒng)，暗示thmea1的缺失可能會(huì)影響銅離子的胞外釋放過(guò)程。
　　5、對(duì)野生菌Th33和敲除突變株△thmea1進(jìn)行了08mM/L銅離